1. Kimihia te ngongo o te otinga RNA
Ko te horomitanga i te 280, 320, 230, me te 260 nm e tohu ana i nga uara o te waikawa karihi, te papamuri (te whakapouritanga o te otinga), te kukū o te tote, me nga mea waro penei i te pūmua.Ko te tikanga titiro anake ki OD260/OD280 (Ratio, R).A, no te 1.8 ~ 2.0, e whakaaro ana matou ka taea te whakararu i te poke o te pūmua, i etahi atu mea waro ranei i roto i te RNA, engari me tohu ko te wa e whakamahia ana a Tris hei parepare ki te kite i te whakaurunga, ka nui ake te uara R i te 2 (te nuinga o te waa <2.2).A, no te R<1.8, ka tino kitea te poke o te pūmua me etahi atu mea waro i roto i te otinga, a ka taea te whakatau i te mate o te RNA i runga i nga hiahia.Ina R>2.2, ko te tikanga kua whakamarohia te RNA ki te waikawa karihi kotahi.
2. Tauira hiko o te RNA
I te nuinga o te waa, ka whakamahia te kaera denaturing mo te RNA electrophoresis, engari mena mo te rapu i te kounga o te RNA anake, karekau e tika te denaturing gel, ka taea te whakamahi i te gel agarose noa.Ko te kaupapa o te electrophoresis ko te kite i te tika o nga roopu 28S me 18S me o raatau tauwehenga, te tika ranei o te paninga mRNA.I te nuinga o te waa, mena he maamaa, he maamaa, he koi nga roopu 28S me te 18S (e tohu ana ki nga tapa o nga roopu he maamaa), a, ko te kanapa o te 28S he nui ake i te rua o te roopu 18S, ka whakaarohia he pai te kounga o te RNA.
Ko nga tikanga i runga ake nei ko nga tikanga e rua e whakamahia ana e matou, engari kaore e taea e enei tikanga e rua te whakaatu marama mena he toenga RNase kei roto i te otinga RNA.Mena he iti rawa te RNase i roto i te otinga, he uaua ki a maatau te kite i te tikanga o runga ake nei, engari ko te nuinga o nga tauhohenga enzymatic o muri mai ka mahia i runga ake i te 37 nga nekehanga me te wa roa.I tenei ara, ki te mea he iti rawa te RNase i roto i te otinga RNA, katahi ka tino pai te taiao me te wa ki te takaro i a raatau mahi i roto i nga whakamatautau ka whai ake, a, ko te tikanga ka makariri te whakamatautau i tenei wa.Kei raro nei ka whakauruhia he tikanga ka taea te whakau mena he toenga RNase kei roto i te otinga RNA.
3. Whakamātautau tiaki wera
E ai ki te tauira kukū, tuhia kia rua nga 1000 ng RNA mai i te otinga RNA ka tapiri atu ki te ngongo centrifuge 0.5 ml, ka taapirihia ki te pH 7.0 Tris buffer ki te tapeke o te 10 ul, ka hiritia te potae o te ngongo.Hoatu tetahi o aua mea ki roto i te pati wai mahana tonu i te 70°C ka whakamahana mo te 1 haora.Ko tetahi atu waahanga i rongoa i roto i te pouaka whakamātao -20°C mo te 1 haora.Ka pau te wa, tangohia nga tauira e rua mo te electrophoresis.I muri i te otinga o te electrophoresis, whakatairitehia nga roopu electrophoretic o te rua.Mena he rite tonu nga roopu o nga mea e rua, kaore ranei he rereketanga nui (ko te tikanga, ka tutuki ano o raatau roopu ki nga tikanga i roto i te tikanga 2), ko te tikanga kaore he toenga o te RNase contamination i roto i te otinga RNA, a he tino pai te kounga o te RNA.Engari, ki te whakaatu te tauira i whakawhaohia i te 70°C i te tino paheketanga, e tohu ana he poke RNase kei roto i te otinga RNA.
2 Nga tikanga whakamatautau me nga tikanga mo te tangohanga RNA
Ko nga raruraru ka pa ki a tatou i te wa e tango ana i te RNA ko: (1) He iti te hua o te RNA;(2) He tino parahanga tote te RNA;(3) Ko te RNA he tino parahanga whakarewa pararopi;(4) te whakaheke tauira me etahi atu raruraru
1. Ka whakamahia nga reagents tangohanga RNA katoa
Ko te tikanga guanidine isothiocyanate me te tikanga Trizol nga tikanga tino whakamahia mo te tangohanga o te RNA katoa mai i nga kopa kararehe me nga pūtau kararehe.He tino pai mo nga tauira iti me nga kopa e tino uaua ana ki te tango, penei i te tangohanga o te RNA katoa mai i te kiri rapeti me te kiko hono kararehe;i tua atu, Trizol, hei reagent lysis whānui, ka taea hoki te whakamahi mo te tangohanga o nga tipu tipu, huakita, harore me etahi atu kopa.Mo nga tipu tipu kei roto i nga polysaccharides me nga polyphenols, penei i te camellia oleifera, nga rau tea, te rapeseed, me etahi atu, ka taea hoki te whakamahi i te tikanga CTAB ki te tango i te RNA katoa.
Ka rite ki te tikanga tikanga, he tino rongonui ano te tikanga pou-rua na runga i tana mahi pāmahana noa, kaore he take ki te taapiri i te RNase, me te haumaru-kaore he chloroform, phenols me etahi atu reagents waro mo te tangohanga.(hua tūtohutia )
2. Te tangohanga o te RNA katoa mai i nga kopa kararehe
(1) Me ngana ki te kowhiri i te kiko hou, mena kaore i te hou (he pai ake i roto i nga marama e toru - 80 ℃ pouaka whakamaroke, tio ranei i roto i te hauota wai. I te wa e tapahi ana te kiko, kaua e tapahia tika i te pāmahana rūma, me tino hoatu ki runga i te pouaka tio, ngana ki te karo i te tio me te whakamaroke tonu.
(2) Whakamahia he kutikuti ma me te kutikuti hei tapahi i tetahi wahi iti o te kopa, ngana ki te tapahi i te waahanga o waenganui o te kopa i te wa e tapahi ana i te tauira, ka tapahia ranei te waahanga nui mai i waenganui, ka tapahia te tauira ki te waahi hou.Ko te kopa kua tangohia me tino tapatapahia, ka makahia te kopa ki roto i te ngongo EP me te kore RNase, te taapiri i te lysate, me tino kitea te kiko ki te lysate, me te whakarite mo te homogenization.
(3) Mo nga kopa noa, whiriwhiria nga kopa piini mung (30-60 mg) mo te whakakotahitanga.Mēnā he nui te pūmua, te ngako, te kiko kiko kiko ranei penei i te ate kei roto i nga kopa, ka tika te whakanui, te whakaheke ranei i te nui o nga kopa kua tapahia (he kowhiria) Kōwhiria te 10~20 mg).
(4) Mēnā ka tangohia te uaua ika, te mīti kōeke, te tiēre me ētahi atu kopa he nui te nui o te wai, me tika te whakanui ake i te rahinga tauira (e taunakitia ana kia 100-200 mg).
(5) Mena ka whakaaetia e nga tikanga, ka taea te tango tika i te kiko kararehe i muri i te whakamohoatanga me te homogenizer kiko teitei, mena kaore he taputapu pera.
(6) Ko te RNA i whiwhi i muri i te tangohanga whakamutunga me whakanoho ki runga i te pouaka hukapapa tonu hei whakaiti i te paheketanga o te RNA.
3. Te tangohanga RNA pūtau kararehe
(1) Pūtau whakatārewatanga: centrifuge tika ka maka i te reo, horoi ki te horomata PBS mō te 1-2 wā, ka whakatārewatia ki te nui tika o PBS, a ka tāpiri lysate mo lysis.Kaua e taapiri tika te lysate ki nga pūtau kua heke i muri i te whakakorenga o te wai.Ma tenei ka tuku te kete histone i muri i nga pūtau lysed i te paparanga o waho ki te piri ki waho o nga pūtau kua heke, na reira ka whakaiti i te whakapiri o nga pūtau kei roto i te pire me te lysate., ka hua mai i te lysis pūtau kaore i oti me te whakaheke i te hua RNA.
(2) Ko nga pūtau e piri ana, kaore ranei i tino piri: I muri i te rukutanga o te reo, horoi ki te PBS mo te 1-2 wa, katahi ka tango tika i te nui o te PBS ka pupuhi i te rihi ahurea ki te pipette, te pu ranei hei pupuhi atu i nga ruma, ka whakawhiti ki nga pūtau RNA-kore.Tāpirihia te lysate ki te ngongo EP o te whākōkī hei tangohanga.
(3) Ko nga pūtau piri: me kena ki te trypsin i te tuatahi, ka kohia ki roto i nga ngongo EP kore-Rnase, centrifuged ki te tango i te supernatant, horoi 1-2 wa ki te PBS ki te tango trypsin i te taikaha, ka whakatārewatia ki te nui tika o PBS Katahi ka haere ki te taahiraa tangohanga.
4. Te tangohanga RNA tipu
He nui te kiko o te tipu ki nga puhui phenolic, he nui ranei te polysaccharides, kei roto ranei etahi metabolites tuarua kaore i te mohiotia, he mahi nui ranei o RNase.Ka honoa enei matū ki te RNA i muri i te lysis o te pūtau ki te hanga i nga matatini korekore, i nga rerenga colloidal ranei, he uaua ki te tango.No reira, ka tango tatou i te kiko tipu, me whiriwhiri he kete mo nga tipu.Ka taea e te lysate i roto i te kete te whakaoti i nga raru o te ngawari o te waikura o te polyphenols me te wehenga o te polysaccharide pūhui me te waikawa karihi.
(Mo te tangohanga RNA tipu RNA polysaccharide polyphenol, nga hua e taunaki ana:
(1) Ko te kiri, te penupenu, nga kakano, nga rau, me era atu mea o te tipu me tino kuia ki roto i te kumete.I te wa o te hurihanga, me whakakiia te hauota wai i te waa kia kore ai e rewa te tauira.Me tere te taapiri i te tauira whenua ki te lysate ka ruia kia kore ai e paheke te RNA.
(2) Mo nga tauira whai kiko o te muka penei i te raihi me te rau witi, me tika te whakaiti i te nui o te tangohanga, ki te kore e oti te huri o te kiko me te lysis, ka iti te hua o te RNA kua tangohia.
(3) Mo nga kopa tipu he nui te nui o te wai, penei i te pamekaranete, hua merengi, hua peach, me etahi atu, me tika te whakanui i te rahi o te tauira (he 100-200 mg he mea whiriwhiri).
(4) Ko nga kopa tipu, penei i te rau tipu, te rhizomes, nga hua maro me etahi atu rawa e taunakitia ana kia whakamahia te hauota wai hei moata i nga kai i roto i te kumete, katahi ka haere ki te mahi tangohanga.Kare pea e whai hua te whakamohoatanga o te kikokiko tikanga ki te whakakotahi i nga kopa tipu, kaore i te tūtohutia.
5. Whakatupato mo te tangohanga RNA
(1) Me tino hou nga tauira o te kopa kia kore ai e topa me te rewa.
(2) Ko te kiko o te kopa me tino whenua i te wa o te tangohanga, me te nui o te kiko kia kaua e iti rawa, waihoki kia nui rawa.
(3) Kia nui te wa inkubasi i muri i te taapiri i te lysate ki te tino lyse te tauira.
(4) A, no te whakamahi i te tikanga Trizol mo te tangohanga, ko te kaupapa o te tango i te supernatant i muri i te stratification he "pai ki te ngongo iti iho i te inhale atu", a me kaua e tango ki te paparanga waenganui, ki te kore ka meinga te reira contamination DNA genomic nui.
(5) I te wa e horoi ana, me uru te wai horoi ki te taha o te pakitara ngongo kia pai ai te horoi.
(6) Mo te tikanga tangohanga o te pou, hei taapiri atu ki te wehe i te pou i muri i te horoinga, me whakanoho ano te pou whakaurunga ki roto i te paepae ultra-ma ka pupuhi mo te 5-10 meneti kia tino whakaeto te whakarewa pararopi ki te maroke.
(7) I te elution whakamutunga o te tikanga tīwae, i muri i te tāpiri wai DEPC, kia incubated mo te 3-5 meneti, ranei te wai DEPC kia whakamahana ki te 60 ° C i mua ki te whakapiki ake i te elution tukua.I roto i te tikanga tuku iho Trizol cleavage me isopropanol precipitation tikanga, te RNA whakamutunga ka rewa i roto i te wai DEPC, na me hoatu he wa e tika ana mo te rewa, me te raro o te ngongo centrifuge kia pupuhi tonu ki te pito pipette.
3 Te toru Nga take me nga otinga mo te iti o te kukū RNA/kounga kino
1. He iti rawa te hua
He iti rawa te tauira kua tangohia, he iti rawa te tapeke, he nui rawa ranei te tauira kua tangohia, kaore ano kia oti te lysis;me whakamahi te kiko, nga pūtau ranei e tika ana te kounga mo te tangohanga, me mahi pai te maimoatanga o mua o te tauira, kia ranea te lysis.
2. Nga toenga genome
A, no te tango i te tikanga Trizol, ka ngote te supernatant ki te paparanga waenganui i muri i te paparanga, ka meinga contamination ira tino nui;kia nui te tiaki i te wa e whakapapa ana kia kore e ngotea ki te paparanga waenga.Mena ka whakamahia te tikanga pou mo te tangohanga, ka taea te kowhiri i tetahi kete kei roto DNase I hei tangohanga.Ko te waikawa nucleic adsorbed i runga i te kiriuhi ka keri tika ki te DNase I, ka taea te whakaiti i nga toenga DNA.
3. Te whakahekenga RNA
Ko te paheketanga pea o te tauira kua tangohia ake, ko te paheketanga ranei i puta i te wa o te tangohanga;i te mea e taea ana, me whakamahi nga tauira hou mo te tangohanga RNA, me penapena nga tauira kua kohia ki roto i te hauota wai, -80°C ranei i roto i te pouaka whakamātao i te wa, me karohia te tio me te whakamaroke.Ko nga tohutohu kore utu RNase/DNase, ngongo centrifuge me etahi atu rauemi me whakamahi i roto i te tukanga tangohanga RNA.Ko te tukanga tangohanga kia tere tonu.Me whakanoho te RNA kua tangohia ki runga i te pouaka tio ka rongoa ki te -80 i te waa.Mena me kitea te RNA kua tangohia e te hiko hiko, me mahi te hiko i muri tonu i te tangohanga, me te whakakapi i te putunga electrophoresis ki te mea hou kua rite.
4. Te tote me te toenga whakarewa pararopi
Kei roto i nga reagents tangohanga te tote phenol me te guanidine, kei roto i te wairewa horoi he waihano.I te wa o te tangohanga, kaore i tino uruhia te lysate me te maka atu, kaore ano i tino maroke te otinga horoi.Ko te toenga o te tote me te wairewa pararopi he kino ki te whakamaoritanga whakamuri me te PCR.Ko nga nekehanga rereke o te aukati, na reira me tino tangohia te lysate kiko i te wa o te tangohanga, me te horoi kia nui te horoi kia taea ai te horoi i nga pakitara a tawhio noa o te ngongo.I tua atu, ka tukuna te ngongo, ka pupuhihia he waahanga e tika ana, ka whakaiti ake i te toenga o te maaka.
Mo etahi atu korero mo te tangohanga RNA, me whai i ta maatau paetukutuku:
www.foreivd.com mo etahi atu korero.
Wā tuku: Tihema-01-2022
