Rauemi timatanga: RNA
Ko te whakamaoritanga whakamuri ine PCR (RT-qPCR) he tikanga whakamatautau i whakamahia i roto i nga whakamatautau PCR ma te whakamahi i te RNA hei rauemi timatanga.I tenei tikanga, ko te RNA katoa, ko te RNA karere ranei (mRNA) ka tuhia tuatahi ki te DNA taapiri (cDNA) ma te whakamuri transcriptase.I muri mai, i mahia he tauhohenga qPCR ma te whakamahi i te cDNA hei tauira.Kua whakamahia te RT-qPCR i roto i nga momo tono koiora irapoi, tae atu ki te tātari ira ira, te whakamanatanga pokanoa RNA, te whakamana microarray, te kitenga pathogen, te whakamatautau ira, me te rangahau mate.
Kotahi-taahiraa me nga tikanga e rua mo te RT-qPCR
Ka taea te whakatutuki i te RT-qPCR ma te tikanga kotahi-taahiraa, e rua-taahiraa ranei.Kotahi-taahiraa RT-qPCR e whakakotahi ana i te whakamaoritanga whakamuri me te whakanui PCR, ka taea te whakamuri transcriptase me te DNA polymerase ki te whakaoti i te tauhohenga i roto i te ngongo kotahi i raro i nga tikanga parepare.Ko te kotahi-taahiraa RT-qPCR anake e hiahia ana ki te whakamahi i nga waahanga-raupapa motuhake.I roto i te RT-qPCR e rua-taahiraa, ka mahia te whakamaoritanga whakamuri me te whakakaha PCR i roto i nga ngongo e rua, ma te whakamahi i nga momo parepare kua arotauhia, nga tikanga tauhohenga, me nga rautaki hoahoa tuatahi.
| Painga | Te kino | |
| Kotahi Hipanga | He iti ake te hapa whakamatautau o tenei tikanga na te mea ka mahia nga tauhohenga e rua ki te ngongo kotahi
He iti ake nga hikoi paipa ka whakaiti i te tupono o te poke
E tika ana mo te whakakaha / whakamaarama teitei, tere me te whakaputa | Ko nga tauhohenga rua-taahiraa e kore e taea te arotau motuhake
I te mea ka taupatupatuhia nga tikanga tauhohenga ma te whakakotahi i te tauhohenga e rua-taahiraa, kaore i te pai te tairongo ki tera o te tikanga e rua-taahiraa.
He iti te maha o nga whaainga ka kitea e te tauira kotahi |
| E rua nga hikoinga | Te kaha ki te hanga whare pukapuka cDNA pumau ka taea te penapena mo nga wa roa ka whakamahia i roto i nga tauhohenga maha
Ko nga ira whainga me nga ira tohutoro ka taea te whakanui mai i te whare pukapuka cDNA kotahi me te kore e hiahiatia he whare pukapuka cDNA maha.
Nga parepare tauhohenga me nga tikanga tauhohenga e taea ai te arotautanga o nga oma tauhohenga kotahi
Te kowhiringa ngawari o nga tikanga keu | Ma te whakamahi i nga ngongo maha, me te maha atu o nga hikoi paipa ka nui ake te tupono o te poke DNA, me te wa e kai ana.
Me nui ake te arotautanga i te tikanga kotahi-taahiraa |
Hua e pā ana:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Kotahi Hipanga)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Kotahi Hipanga)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Kaiwhakaako Premix Mo te Waahanga CDNA Tuatahi
Wā Tuturu PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Te kowhiringa o te RNA katoa me te mRNA
I te wa e hoahoa ana i tetahi whakamatautau RT-qPCR, he mea nui ki te whakatau mena ka whakamahia te RNA katoa, te mRNA kua purea ranei hei tauira mo te tuhi whakamuri.Ahakoa ka taea e te mRNA te whakarato i te tairongo paku ake, ka whakamahia tonu te RNA katoa.Ko te take mo tenei ko te RNA katoa he painga nui ake hei mea timatanga atu i te mRNA.Tuatahi, me iti ake nga mahi purenga, e pai ake ai te whakaora ine ine o te tauira me te pai ake o nga hua ki te timata i nga tau waea.Tuarua, ka karo i te hikoi whakarangatira mRNA, ka taea te karo i nga hua karekau na te rereke o nga whakaoranga o nga mRNA rereke.I te nuinga o te waa, i te nuinga o nga tono he mea nui ake te inenga o te ira whaanui i te tino aro o te kitenga, he pai ake te RNA katoa i te nuinga o nga keehi.
Tuhinga o mua
I roto i nga tikanga e rua-taahiraa, ka taea te whakamahi i nga tikanga rereke e toru ki te whakauru i te tauhohenga cDNA: oligo(dT) tuatahi, matapōkeretia matapōkere, raupapa-motuhake ranei.I te nuinga o te waa, ka whakamahia nga papaamata oligo(dT) me nga matapōkeretia.Ko enei mea tuatahi ka hono atu ki te whenu mRNA tauira me te tuku whakamuri transcriptase me te timatanga mo te whakahiato.
| Kōwhiringa tuatahi | Te hanganga me te mahi | Painga | Te kino |
| Oligo(dT) tuatahi (te oligo(dT) punga tuatahi) | Te roa o te whakaene ki nga toenga o tomine i te poly(A) hiku o te mRNA;Ko te tuatahi o te punga oligo(dT) he G, C, A ranei kei te pito 3′ (pae punga) | Te whakahiatotanga o te cDNA roa-katoa mai i te poly(A)-tailed mRNA
E tika ana ina iti ake nga rauemi timatanga e waatea ana
Ko te waahi punga ka whakarite kia piri te oligo(dT) tuatahi ki te 5′ poly(A) hiku o te mRNA | He pai anake mo te whakanui i nga ira me nga hiku poly(A).
Tikina cDNA kua tapahia mai i te waahi tuatahi*2 i te poly(A)
He pai ki te here ki te pito 3′*
*Ka whakaitihia tenei tupono mena ka whakamahia nga tohu tuatahi oligo(dT). |
| matapōkeretia tuatahi
| E 6 ki te 9 nga turanga te roa, ka taea te whakauru ki nga waahi maha i te wa o te tuhi RNA | Apiti ki nga RNA katoa (tRNA, rRNA, me te mRNA)
E tika ana mo nga tuhinga whai hanganga tuarua nui, ina iti ake ranei nga rauemi timatanga e waatea ana
Te Hua cDNA teitei | Ko te cDNA he mea whakamuri te tuhi mai i nga RNA katoa, kaore e hiahiatia ana ka waimeha pea te tohu o te mRNA whainga.
kia tapahia cDNA |
| raupapa-motuhake tuatahi | Ko nga kaupapa tuatahi e aro ana ki nga raupapa mRNA motuhake | whare pukapuka cDNA motuhake
Whakapai ake te tairongo
Ma te whakamahi i nga tohu tuatahi qPCR whakamuri | He iti noa iho ki te whakahiatotanga o te ira kotahi |
Whakamuri transcriptase
Ko te transcriptase whakamuri he whākōkī e whakamahi ana i te RNA ki te whakahiato i te DNA.Ko etahi o nga tuhinga whakamuri he mahi RNase ka taea te whakaheke i nga whenu RNA i roto i nga whenu ranu RNA-DNA i muri i te tuhi.Mena kaore he mahi enzymatic RNase, ka taea te taapiri RNaseH mo te kaha o te qPCR teitei ake.Ko nga whākōkī e whakamahia ana ko te Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase me te avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Mo te RT-qPCR, he mea pai ki te whiriwhiri i te whakawhitinga whakamuri me te teitei o te thermostability, kia taea ai te mahi cDNA synthesis i nga teitei teitei ake, me te whakarite i te tuhi angitu o nga RNA me te hanganga tuarua teitei ake, me te pupuri i to raatau mahi katoa puta noa i te tauhohenga, ka hua ake nga hua cDNA.
Hua e pā ana:
Foreasy M-MLV Whakamuri Transcriptase
RNase H mahi o te whakamuri transcriptase
Ka taea e RNaseH te whakaheke i nga whenu RNA mai i te RNA-DNA duplexes, ka taea te whakahiato pai o te DNA taurua.Heoi, ina whakamahi i te mRNA roa hei tauira, ka paheke te RNA i te wa oata, ka mutu ka tapahia te cDNA.Na reira, he pai tonu te whakaiti i te mahi RNaseH i te wa o te cDNA cloning mena ka hiahia te whakahiato o nga tuhinga roa.He rereke, ko nga whakawhitinga whakamuri me te mahi RNase H he maha nga painga mo nga tono qPCR na te mea ka whakarei ake i te whakarewatanga o nga taarua RNA-DNA i te huringa tuatahi o te PCR.
Te hoahoa tuatahi
Ko nga papa tuatahi PCR e whakamahia ana mo te taahiraa qPCR i roto i te RT-qPCR he mea tika kia hangaia kia awhi i tetahi hononga exon-exon, i reira ka taea e te tuatahi whakakaha te toro atu ki tetahi rohe exon-intron.I te mea kaore i te whakanuia nga raupapa DNA genomic intron, na tenei hoahoa ka whakaiti i te tupono o nga hua pai teka ka whakanuia mai i te whakapoke i te DNA genomic.
Ki te kore e taea te hoahoa tuatahi ki te wehe i nga rohe exon, exon-exon ranei, tera pea me rongoa nga tauira RNA me te RNase-kore DNase I, dsDNase ranei hei tango i te poke DNA ira.
Mana RT-qPCR
Me whakauru he mana toraro whakamuri whakawhiti (-RT mana) ki nga whakamatautau RT-qPCR katoa kia kitea te poke DNA (pēnei i te DNA genomic, hua PCR ranei mai i nga tauhohenga o mua).Kei roto i tenei mana nga waahanga tauhohenga katoa engari ko te transcriptase whakamuri.I te mea karekau te tuhi whakamuri e puta me tenei mana whakahaere, mena ka kitea te whakakaha PCR, he poke mai i te DNA.
Wā tuku: Akuhata-02-2022
