I roto i nga whakamatautau qPCR, he hononga nui ano te hoahoa tuatahi.Ahakoa e tika ana nga mea tuatahi, kaore ranei he hononga tata ki te eke ki te paerewa, ahakoa he mea motuhake nga hua whakakaha, me nga hua whakamatautau kei te waatea.
Na me pehea te pai ake o te tohu tuatahi o te qPCR?Te kaha whakakaha teitei?
I tenei ra, ka haria koe e matou ki te hoahoa tahi i nga waahanga tuatahi o te qPCR, ka waiho ko te hoahoa tuatahi o te qPCR hei tohunga mohio ki nga whakamatautau.
I te wa e hoahoa ana i nga waahanga tuatahi o te qPCR, me aro nui ki nga waahanga e whai ake nei: me hoahoa nga mea tuatahi puta noa i nga introns ka taea, ko te roa o te hua kia 100-300 bp, ko te uara Tm kia tata ki te 60°C, ko nga papaaarangi o runga me o raro kia tata ka taea, ko te mutunga o te tuatahi kia G, C, aha atu.
1. Hoahoa o nga mea tuatahi e hora ana i nga whakaurunga
I te wa e hoahoa ana i nga kaupapa tuatahi qPCR, ko te kowhiri i nga kaupapa tuatahi i hangaia puta noa i nga whakaurunga ka taea te aukati i te tauira gDNA kia kaua e whakanuia, ka ahu katoa nga hua mai i te whakakaha o te cDNA, na reira ka whakakorea te awe o te poke o te gDNA.
2. Roa tuatahi
Ko te roanga tuatahi kei waenga i te 18-30 nt, a me whakahaere te roa o te hua whakakaha i waenga i te 100-300 bp kia taea.
Mena he poto rawa te papa tuatahi, ka piki ake te whakakaha kore-motuhake, a, ki te roa rawa, ka ngawari te hanga i te hanganga tuarua (penei i te hanganga makawe).Mena he roa rawa te hua whakakaha, kaore e pai mo te tauhohenga o te polymerase, ka pa ki te pai o te PCR amplification.
3. Te ihirangi GC me te uara Tm
Ko te ihirangi GC o nga mea tuatahi me whakahaere i waenga i te 40% me te 60%.Mena he tiketike rawa, he iti rawa ranei, kaore e pai ki te timata i te tauhohenga.Ko te ihirangi GC o te matamua whakamua me te whakamuri kia tata ki te rite kia whiwhi ai i te uara Tm rite me te pāmahana whakahiato.
Ko te uara Tm me noho i waenga i te 55-65°C i te wa e taea ana, i te nuinga o te waa ki te 60°C, me te uara Tm o te whakarunga me te taha whakararo kia tata rawa atu, he pai ake kia kaua e neke ake i te 4°C.
4. A ape i te kowhiri i te A kei te pito 3′ o te tuatahi
Ki te kore e taurite te pito 3′ o te tuatahi, he nui nga rereketanga o te pai o te whakahiato o nga turanga rereke.Ina ko te turanga whakamutunga ko A, ka taea ano e ia te timata i te whakahiato mekameka ahakoa he rereke te rite, a ko te turanga whakamutunga ko T Ina, ka tino heke te kaha o te whakaurunga koretake.No reira, ngana ki te karo i te kowhiri i te A i te pito 3′ o te tuatahi, he pai ake te kowhiri i te T.
Mēnā he pūmua rangahau, ko te 5′ te pito o te rangahau e kore e taea te G, na te mea ahakoa ka hono tetahi turanga G kotahi ki te roopu kaikawe korero a FAM, ka taea ano e G te tinei i te tohu rewharewha i tukuna e te roopu FAM, ka puta he hua kino kino.Ka puta.
5. Te tohatoha turanga
Ko te tohatoha o nga turanga e wha i roto i te tuatahi he mea matapōkeretia, ka karo atu i te 3 karapīpiti G, C ranei i te mutunga 3′, me te neke atu i te 3 karapīpiti.He ngawari a G, C ranei ki te whakaputa takirua i roto i te rohe raupapa-a-GC.
6. Ko te rohe hoahoa tuatahi me karo i nga hanganga tuarua matatini.
Ko te hanganga tuarua i hangaia e te whenu kotahi o te hua whakakaha ka pa ki te pai o te ahunga whakamua o te PCR.Ma te matapae mehemea he hanganga tuarua kei roto i te raupapa whaainga i mua, ngana ki te karo i tenei rohe i roto i te hoahoa o nga kaupapa tuatahi.
7. Ko nga papa tuatahi me waenga i nga papa tuatahi me ngana ki te karo i nga turanga taapiri karapīpiti.
Karekau he taurite 4 turanga i waenga i te tuatahi me te tuatahi.Ko te mea tuatahi kia kaua e whai raupapa taapiri, ki te kore, ka kopakohia kia hanga he anga makawe, ka pa ki te whakakotahitanga whakaene o te tuatahi me te tauira.
Kare e taea e nga raupapa taapiri te noho i waenga i nga timatanga o runga me te taha whakararo.Ko te whakakotahitanga i waenga i nga kaimatai ka whakaputa i nga dimer tuatahi, ka whakaitihia te pai o te PCR me te pa ki te tika o te ine.Mena kare e taea te karo i nga hanganga-a-rima me te makawe makawe, kia kaua e nui rawa te uara △G (me iti iho i te 4.5 kcal/mol).
8. Ko nga mea tuatahi ka whakanui i te hua motuhake kua tohua.
Ko te tino whainga o te kitenga qPCR ko te mohio ki te nui o te ira i whaaia.Mena ka puta te whakakaha kore-motuhake, ka he te ine ine.Na reira, i muri i te hoahoanga o nga mea tuatahi, me whakamatauria e te BLAST, ka whakatauritehia te motuhake o nga hua ki te paparangi raupapa.
I muri mai, ka tangohia e matou te ira tangata GAS6 (Growth arrest specific 6) hei tauira ki te hoahoa i nga tohu tuatahi qPCR.
01 uira ira
Homo GAS6na roto i te NCBI.I konei, me aro tatou ki te whakatairite i te ingoa ira me nga momo kia rite tonu.
02 Kimihia te raupapa ira
(1) Mēnā he DNA genomic te raupapa whainga, tohua te tuatahi, ko te raupapa DNA genomic o te ira.
(2) Mena ko te mRNA te raupapa whainga, tohua te waahanga tuarua.I muri i te whakaurunga, paatohia te "CDS" i te ripanga i raro nei.Ko te raupapa papamuri parauri ko te raupapa tohu o te ira.
03 Nga kaupapa hoahoa
Whakauruhia te atanga Primer-BLAST
Whakauruhia te tau raupapa ira, te raupapa ranei ki te whakatakotoranga Fasta i te taha maui o runga, ka whakakiia nga tawhā e tika ana.

Paatohia te "Tikina nga tohu tuatahi" ka puta ake te NCBI ki te korero ki a koe ka whakanuia te kowhiringa tawhā ki etahi atu momo taapiri.Ka taea e taatau te tirotiro i nga momo momo taapiri ka tukuna kia whiwhi i te takirua tuatahi e tika ana (e whakaatuhia ana i te ahua i raro nei).He tekau hēkona pea te roa o tenei tukanga.
Kei te 60°C te mahana o enei takirua tuatahi.E ai ki te kaupapa o te whakamatautau, kowhiria nga mea tuatahi he iti te roa, he pai te motuhake me te iti ake o te whakakii i a ia ano o nga mea tuatahi mo te whakamatautau, a he tino tiketike te reeti angitu!
04Primer motuhake manatokonga
Inaa, i tua atu i te hoahoa tuatahi, ka taea hoki e Primer-Blast te arotake i nga kaupapa tuatahi i hangaia e matou.Hoki atu ki te wharangi hoahoa tuatahi, uru atu ki nga papaaarangi o runga me o raro i hangaia e matou, a ka kore e whakatikahia etahi atu tawhā.I muri i te tukunga, ka kite koe mena kei te noho ano te takirua o nga tuatahi ki etahi atu ira.Mena ka whakaatuhia katoa ki runga i te ira e hiahia ana matou ki te whakanui ake , e tohu ana he pai te motuhake o tenei takirua tuatahi!(Hei tauira, koinei anake te hua o te patai tuatahi!)

05 Te whakatau o te kounga tuatahi
He aha te ahua o te pukapuka tuatahi "tino pai" e whakakotahi ana i te "whakapaipai ake ki te paerewa", "nga ahuatanga hua whakakaha", me "nga hua whakamatautau pono"?
Te kaha whakakaha

ānau rewa
Ko te kaha o te whakakaha o nga mea tuatahi ka tae ki te 90% -110%, ko te tikanga he pai te kaha o te whakakaha, a ko te pihi whakarewa he tihi kotahi me te tikanga Tm>80°C, ko te tikanga he pai te motuhake o te whakakaha.
 
Hua e Pa ana:
Wā Tūturu PCR Easy–SYBR GREEN I
Wā Tūturu PCR Easy-Taqman