Ka whakamahia e te hangarau molecular diagnostic nga tikanga koiora molecular molecular biology ki te kite i te whakapuakitanga me te hanganga o nga mea ira o te tinana tangata me nga momo tukumate, kia tutuki ai te kaupapa o te matapae me te tirotiro i nga mate.

I nga tau kua pahure ake nei, me te whakahou me te whakahou i te hangarau taatai ​​rapoi, kua piki ake te tono haumanu o nga taatai ​​rapoi i te hohonutanga me te hohonu, a kua uru te maakete taatai ​​rapoi ki te waa o te whanaketanga tere.

Ka whakarāpopotohia e te kaituhi nga hangarau taatai ​​irapoi noa i runga i te maakete, ka wehea ki nga wahanga e toru: ko te waahanga tuatahi ko te hangarau PCR, ko te waahanga tuarua ko te hangarau whakakaha isothermal waikawa nucleic, ko te waahanga tuarua ko te hangarau raupapa.

01

Wāhanga I: Hangarau PCR

Hangarau PCR

Ko te PCR (polymerase chain reaction) tetahi o nga hangarau whakakaha DNA in vitro, neke atu i te 30 tau te hitori.

Ko te hangarau PCR i pionia i te tau 1983 e Kary Mullis o Cetus, USA.I tono a Mullis mo te patent PCR i te tau 1985 ka whakaputa i te pepa matauranga PCR tuatahi mo te Putaiao i taua tau ano.I toa a Mullis i te Nobel Prize in Chemistry i te tau 1993.

Nga Tikanga Taketake o te PCR

Ka taea e PCR te whakanui ake i nga kongakonga DNA e whaa ana neke atu i te kotahi miriona wa.Ko te maataapono kei raro i te whakamaaramatanga o te DNA polymerase, ka whakamahia te whenu matua DNA hei tauira, ka whakamahia he tohu tuatahi hei timatanga mo te toronga.Ka tukuna i roto i te vitro ma nga taahiraa penei i te denaturation, annealing, me te toronga.Ko te tukanga o te DNA whenu tamahine e hono ana ki te DNA tauira whenu matua.

Ko te tukanga PCR paerewa kua wehea kia toru nga waahanga:

1. Te whakaheke: Whakamahia te pāmahana teitei hei wehe i nga whenu takirua DNA.Ko nga here hauwai i waenga i nga whenu takirua DNA ka pakaru i te wera nui (93-98°C).

2. Ainea: I muri i te wehenga o te DNA whenu-rua, ka whakahekehia te pāmahana kia taea ai e te tuatahi te here ki te DNA whenu kotahi.

3. Toronga: Ka timata te DNA polymerase ki te whakahiato i nga whenu taapiri ki te taha o nga whenu DNA mai i nga mea tuatahi ka herea ina whakahekehia te pāmahana.Ka oti te toronga, ka oti he huringa, ka ruarua te maha o nga kongakonga DNA.

Ko te whakahoki i enei taahiraa e toru 25-35 nga wa, ka piki ake te maha o nga kongakonga DNA.

Ko te mohiotanga o te PCR ko te mea ka taea te hoahoa i nga momo ira tuatahi mo nga momo momo ira, kia taea ai te whakanui i nga kongakonga ira ira i roto i te wa poto.

I tenei wa, ka taea te wehea te PCR ki nga waahanga e toru, ara ko te PCR noa, ko te PCR ine ine me te PCR mamati.

Ko te reanga tuatahi o te PCR noa

Whakamahia he taputapu whakakaha PCR noa hei whakanui ake i te ira e whai ana, katahi ka whakamahi i te electrophoresis gel agarose kia kitea ai te hua, ka taea anake te mahi tātaritanga kounga.

Ko nga tino kino o te reanga tuatahi PCR:

-Ka kaha ki te whakakaha kore-motuhake me nga hua pai teka.

-He roa te wa e kitea ana, he uaua te mahi.

-Ka taea anake te whakamatautau kounga.

PCR ine ine reanga tuarua

Ko te PCR ine ine (Real-Time PCR), e kiia ana ko qPCR, ka whakamahia ki te aro turuki i te whakaemi o nga hua whakakaha i roto i te whakaemi o nga tohu kareoro ma te taapiri i nga rangahau kareoro e tohu ana i te ahunga whakamua o te punaha tauhohenga, me te whakatau i nga hua na roto i te ānau fluorescence, ka taea te tatau ma te awhina o te uara Cq me te paerewa paerewa.

Na te mea kei te whakahaerehia te hangarau qPCR i roto i te punaha kati, ka iti ake te tupono o te poke, ka taea te aro turuki i te tohu fluorescence mo te kitenga ine, no reira ko te nuinga o te whakamahi i roto i nga mahi haumanu, a kua waiho hei hangarau nui i roto i te PCR.

Ko nga matū korikori e whakamahia ana i roto i te PCR ine-a-wa-tuuturu ka taea te wehea ki: TaqMan nga rangahau kookoro, nga rama rama rapoi me nga waikano korakora.

1) TaqMan karewharewha rangahau:

I te wa e whakakaha ana te PCR, ka taapirihia he maataki rewharewha motuhake i te wa e taapiri ana i te takirua tuatahi.Ko te rangahau he oligonucleotide, a ko nga pito e rua kua tapaina ki te roopu kairipoata me te roopu rewharewha tinei.

I te wa e mau tonu ana te rangahau, ko te tohu kareoro e tukuna ana e te roopu kairipoata ka uru ki te roopu tinei;i te wa e whakanuia ana te PCR, ko te mahi exonuclease 5′-3′ a Taq enzyme ka mawehe, ka whakaheke i te rangahau, ka hanga i te roopu kaikawe korero me te tiihi Ka wehea te roopu kareoro, kia taea ai e te punaha aro turuki i te tohu reera, ara, i nga wa katoa ka whakanuia te whenu DNA, he tohu whakakorikori me te hangai o te hangahanga o te hangai. te hua PCR.

2) SYBR waikano rewharewha:

I roto i te punaha tauhohenga PCR, ka taapirihia te taikaha o te waikano korikori SYBR.I muri i te whakaurunga kore-motuhake o te waikano rewharewha SYBR ki roto i te whenu-rua DNA, ka puta he tohu rewharewha.Ko te ngota waikano SYBR kaore i whakauruhia ki roto i te mekameka e kore e whakaputa i tetahi tohu rewharewha, na reira ka whakapumau i te tohu rewharewha Ko te pikinga o nga hua PCR ka tino tukutahi me te piki o nga hua PCR.Ko te SYBR anake e herea ana ki te DNA whenu-rua, na reira ka taea te whakamahi i te pihi rewa hei whakatau mena he mea motuhake te tauhohenga PCR.

3) Nga rama rama ngota

He toronga oligonucleotide tapanga-rua-taakau ka hanga he anga makawe mo te 8 nga turanga i nga pito 5 me te 3.Ko nga raupapa waikawa karihi i nga pito e rua ka honoa, na te mea ka piri te roopu rekoata me te roopu tinei.Katia, e kore e puta te korakora.

I muri i te whakaputanga o te hua PCR, i te wa o te mahi whakaene, ka honoa te wahanga o waenganui o te ramarama rapoi ki tetahi raupapa DNA motuhake, a ka wehea te ira rewharewha mai i te ira tineia hei whakaputa i te rewharewha.

Ko nga tino kino o te PCR whakatipuranga tuarua:

Kei te ngaro tonu te tairongo, a, kaore i te tika te kitenga o nga tauira tauira iti.

He awe i te uara papamuri, a he whakaraerae te hua ki te pokanoa.

Whakatupuranga tuatoru PCR mamati

Ko te PCR Mamati (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) te tatau i te tau kape o te raupapa i whainga ma te rapunga ira-mutunga, ka taea te mahi i te rapunga ine tino tika me te kore e whakamahi i nga mana o roto me nga pihi paerewa.

Ka whakamahia e te PCR Mamati te rapunga mutunga me te kore e whakawhirinaki ki te uara Ct (paepae huringa), na reira ka iti ake te paanga o te tauhohenga PCR mamati e te kaha o te whakakaha, me te pai ake o te manawanui ki nga aukati tauhohenga PCR, me te tino tika me te whakaputa.

Na nga ahuatanga o te tino aro nui me te tino tika, kaore i te ngawari ki te whakararu i nga aukati tauhohenga PCR, a ka taea e ia te whakatutuki i te ine tino pono kaore he hua paerewa, kua waiho hei rangahau me te hotspot tono.

E ai ki nga ahua rereke o te waeine tauhohenga, ka taea te wehewehe kia toru nga momo: microfluidic, chip and droplet system.