Ko te uara Ct te ahua tino nui o te whakaaturanga hua o te PCR ine kareoro.Ka whakamahia ki te tatau i nga rereketanga korero ira me te tau kape ira.Na, he aha te uara Ct o te ine ine rewharewha e kiia ana he whaitake?Me pehea te whakarite i te awhe whai hua o te uara Ct?
He aha te Uara Ct?
I roto i te tukanga whakakaha qPCR, ko te tau e rite ana o nga huringa whakakaha (Taupiri Hurihuri) ka tae te tohu o te hua whakakaha ki te paepae fluorescence kua whakaritea.Ko te C ko te Porohita me te T mo te Paepae.Me korero noa, ko te uara Ct ko te maha o nga huringa e pa ana ki te wa ka tae te whakakaha tauira tuatahi ki tetahi nui o te hua i roto i te qPCR.Ko te mea e kiia ana ko "tetahi nui o te hua" ka whakamaramahia i muri mai.
He aha te mahi a te uara Ct?
1.He hononga i waenga i te whakakaha taupūtanga, te nui o te tauira me te uara Ct
Ko te tikanga, ko nga ira i roto i te qPCR ka whakaemihia e te whakakaha taupūtanga i muri i te maha o nga huringa.Ko te hononga i waenga i te maha o nga huringa whakakaha me te nui o nga hua ko: Te rahinga hua kua whakanuia = te nui tauira tuatahi × (1+En) tau huringa.Engari, ko te tauhohenga qPCR kaore i te pai i nga wa katoa.Ina tae te nui o te hua whakakaha ki te "nui hua", ko te maha o nga huringa i tenei wa ko te uara Ct, kei roto i te waa whakakaha taupūtanga.Te hononga i waenga i te uara Ct me te nui o te tauira timata: He hononga rarangi kei waenganui i te uara Ct o te tauira me te taukohiko o te tau kape timatanga o te tauira.Ko te teitei o te kukū tauira tuatahi, ka iti ake te uara Ct;ka iti iho te kukū tauira tuatahi, ka nui ake te uara Ct.
2.Amplification curve, fluorescence paepae me etahi hua PCR nui
Ko te nui o te hua whakakaha qPCR e whakaatuhia tika ana i roto i te ahua o te tohu rewharewha, ara, te pihi whakakaha.I te timatanga o te PCR, ko te whakakaha i raro i nga tikanga tino pai, he iti te maha o nga huringa, he iti te kohinga hua, a kaore e taea te wehe i te taumata o te fluorescence mai i te papamuri fluorescence.I muri i tera, ka piki ake te rewharewha ka uru ki te wahanga taupū.Ko te nui o te hua PCR ka kitea i tetahi wa ka noho noa te tauhohenga PCR i roto i te wahanga taupū, ka taea te whakamahi hei "tetahi nui o te hua", ka taea te tango i nga ihirangi tuatahi o te tauira mai i tenei.Na reira, ko te kaha o te tohu ororongo e rite ana ki tetahi nui o te hua ko te paepae korikori.
I te wa mutunga o te PCR, kua kore e whakaatuhia e te kurupae whakakaha te whakakaha taupūtanga, ka uru ki te wahanga raina me te wahanga paparahi.
3.Reproducibility o Ct uara
Ka tae te huringa PCR ki te tau huringa o te uara Ct, kua uru mai ki te waa whakakaha taupūtanga pono.I tenei wa, kaore i te whakanuihia te hapa iti, no reira he pai te reproducibility o te uara Ct, ara, ko te tauira kotahi ka whakanuia i nga wa rereke, i nga ngongo rereke ranei i te wa kotahi.Ko te whakakaha, he rite tonu te uara Ct.
1.Te kaha whakakaha En
Ko te pai o te whakakaha PCR e pa ana ki te kaha o te polymerase ki te huri i te ira kia whakakaha hei amplicon.He 100% te pai o te whakakaha i te wa e huri ana tetahi ngota ngota DNA ki nga ngota DNA e rua.Ko te kaha o te whakanui i te kaha e kiia ana ko En.Hei whakahaere i te tātaritanga o nga tuhinga ka whai ake, ko nga mea e pa ana ki te kaha o te whakakaha ka tukuna pototia.
| Nga mea whakaawe | whakamārama | Me pehea te whakawa? |
| A. nga aukati PCR | 1. Kei roto i te tauira DNA nga matū e aukati ana i te tauhohenga PCR, penei i te pūmua me te horoi horoi.2. Kei roto i te cDNA i muri i te whakamaoritanga whakamuri he kukū teitei o te tauira RNA, RT reagent wae ranei, ka taea hoki te aukati i te tauhohenga PCR o muri mai. | 1. Mehemea he parahanga ka taea te whakatau ma te ine i te tauwehenga o A260/A280 me A260/A230, RNA electrophoresis ranei.2. Mehemea ka waimeha te cDNA i runga i tetahi owehenga i muri i te tuhi whakamuri. |
| B. He ahua kino te hoahoa tuatahi | Karekau e pai te whakaene i nga kaupapa tuatahi | Tirohia nga tohu tuatahi mo nga tohu-a-maamaa, he pine makawe ranei, he rerekee, me etahi wa ka huri i nga hoahoa intronic. |
| C. He hoahoa hootaka tauhohenga PCR kino | 1. Kaore e taea e nga papa tuatahi te whakaene2. He iti te tukunga o te DNA polymerase 3. Kua heke te mahi polymerase DNA mo te wa roa | 1. He teitei ake te pāmahana whakaene i te uara TM o te tuatahi2. He poto rawa te wa i mua i te whakahekenga 3. He roa rawa te wa o ia wahanga o te tukanga tauhohenga |
| D. He iti rawa te whakaranu o nga reagents me nga hapa paipa | I roto i te punaha tauhohenga, he tiketike rawa te kukū o nga waahanga tauhohenga PCR, he koretake ranei, na te mea ko te whakakaha kore-tauputanga o te whakanui PCR | |
| E. Amplicon Te roa | He roa rawa te roa o te amplicon, neke atu i te 300bp, he iti te kaha o te whakakaha | Tirohia kei waenganui i te 80-300bp te roa amplicon |
| F. Te awe o nga reagents qPCR | He iti te kukū o te DNA polymerase i roto i te reagent, karekau ranei te kukū o nga katote i roto i te katote i te arotau, na reira ka kore e eke te ngohe o te enzyme Taq ki te teitei. | Te whakatau i te kaha o te whakakaha ma te pihi paerewa |
2.Awhe o nga uara Ct
Ko nga uara Ct mai i te 15-35.Mena he iti ake te uara Ct i te 15, ka whakaarohia ko te whakakaha kei roto i te awhe o te waa turanga, a, kaore ano kia eke ki te taumata o te rangi.Ko te mea pai, he hononga raina kei waenganui i te uara Ct me te taukohiko o te tau kape tuatahi o te tauira, ara, te anau paerewa.Na roto i te anau paerewa, ina 100% te kaha whakakaha, ko te uara Ct tatau mo te ine i te tau kape kotahi o te ira kei te tata ki te 35. Mena he nui ake i te 35, ko te tau kape tuatahi o te tauira he iti iho i te 1, ka kiia he koretake.
Mo nga awhe ira Ct rereke, na te rereketanga o te tau kape ira me te kaha o te whakakaha i te nui o te tauira tuatahi, me hanga he anau paerewa mo te ira me te tatau i te awhe rapunga rarangi o te ira.
3. Te awe i nga ahuatanga o te uara Ct
Mai i te hononga i waenga i te maha o nga huringa whakakaha me te nui o te hua: te nui o te hua kua whakanuia = te nui o te tauira tuatahi × (1+En) tau huringa, ka kitea i raro i nga tikanga pai, ka pa atu te nui o te tauira tuatahi me te En ki te uara Ct.Ko te rereketanga o te kounga o te tauira, te kaha whakakaha ranei ka nui rawa te uara Ct, he iti rawa ranei.
He nui rawa, he iti rawa ranei te uara 4.Ct
Wā tuku: Feb-22-2023
