Ko te PCR (polymerase chain reaction) tetahi o nga hangarau whakakaha DNA in-vitro, neke atu i te 30 tau te hitori.

Ko te hangarau PCR i pionia e Kary Mullis o Cetus, USA i te tau 1983. I tono a Mullis mo te patent PCR i te tau 1985 me te whakaputa i te pepa matauranga PCR tuatahi mo te Putaiao i taua tau ano.I whakawhiwhia a Mullis ki te Nobel Prize in chemistry i te tau 1993 mo ana mahi.

Nga Tikanga Taketake o te PCR

Ka taea e PCR te whakanui ake i nga kongakonga DNA e whaa ana neke atu i te kotahi miriona wa.Ko te maataapono kei raro i te whakamaaramatanga o te DNA polymerase, ma te whakamahi i te whenu DNA matua hei tauira me te tuatahi hei timatanga mo te toronga.Ka tukuna i roto i te vitro ma nga taahiraa penei i te denaturation, annealing, me te toronga.Ko te tukanga o te DNA whenu tamahine e hono ana ki te DNA tauira whenu matua.

Ko te tukanga PCR paerewa kua wehea kia toru nga waahanga:

1.Denaturation: Whakamahia te pāmahana teitei hei wehe i nga whenu takirua DNA.Ka pakaru te here hauwai i waenga i nga whenu takirua DNA i te pāmahana teitei (93-98 ℃).

2. Te whakawhanaunga: I muri i te wehewehenga o te DNA whenu-rua, whakahekehia te pāmahana kia taea ai e te tuatahi te here ki te DNA whenu kotahi.

3.Torohanga: Ka timata te DNA polymerase ki te whakahiato i nga whenu taapiri ki te taha o nga whenu DNA mai i nga mea tuatahi e herea ana ina whakahekehia te pāmahana.Ka oti te toronga, ka oti he huringa, ka ruarua te maha o nga kongakonga DNA

Ko te whakahoki i enei taahiraa e toru 25-35 nga wa, ka piki ake te maha o nga kongakonga DNA.

Ko te mohiotanga o te PCR ko te mea ka taea te hoahoa i nga momo ira tuatahi mo nga momo momo ira, kia taea ai te whakanui i nga kongakonga ira ira i roto i te wa poto.

I tenei wa, ka taea te wehea te PCR ki nga waahanga e toru, ara ko te PCR noa, ko te PCR ine ine me te PCR mamati.

Ko te reanga tuatahi o te PCR noa

Whakamahia he taputapu whakakaha PCR noa hei whakanui ake i te ira e whai ana, katahi ka whakamahi i te electrophoresis gel agarose kia kitea ai te hua, ka taea anake te mahi tātaritanga kounga.

Ko nga tino kino o te reanga tuatahi PCR:

1.Prone ki te whakakaha kore-motuhake me nga hua pai teka.

2.He roa te wa e kitea ana, he uaua te mahi.

3.Ka taea anake te whakamatautau kounga

Whakatupuranga Tuarua PCR Wā-tūturu

Ko te PCR Wā-Tuturu, e mohiotia ana ko qPCR, e whakamahi ana i nga rangahau koorero e tohu ana i te ahunga whakamua o te punaha tauhohenga, me te aro turuki i te whakaeminga o nga hua whakakaha ma te whakaemi o nga tohu korikori, me te whakatau i nga hua ma te pihi korikori.Ka taea te tatau ma te awhina o te uara Cq me te pihi paerewa.

Na te mea kei te whakahaerehia te hangarau qPCR i roto i te punaha kati, ka iti ake te tupono o te poke, ka taea te aro turuki i te tohu fluorescence mo te kitenga ine, no reira ko te nuinga o te whakamahi i roto i nga mahi haumanu, a kua waiho hei hangarau nui i roto i te PCR.

Ko nga matū korikori e whakamahia ana i roto i te PCR ine ine-wa-tuuturu ka taea te wehewehe ki: TaqMan te tirotiro kareoro, nga rama rapoi me te waikano rewharewha.

1)TaqMan te tirotiro karewharewha:

I te wa e whakakaha ana te PCR, ka taapirihia he rangahau karewharewha motuhake i te taapiri i te takirua tuatahi.He oligonucleotide te rangahau, a kua tapaina nga pito e rua ki te roopu rekoata kairipoata me te roopu rewharewha tinei.

I te wa e mau tonu ana te rangahau, ko te tohu kareoro e tukuna ana e te roopu kairipoata ka uru ki te roopu tinei;i te wa e whakanuia ana te PCR, ko te mahi exonuclease 5′-3′ a Taq enzyme ka mawehe, ka whakaheke i te rangahau, ka hanga i te roopu kaikawe korero me te tiihi Ka wehea te roopu kareoro, kia taea ai e te punaha aro turuki i te tohu reera, ara, i nga wa katoa ka whakanuia te whenu DNA, he tohu whakakorikori me te hangai o te hangahanga o te hangai. te hua PCR.

2) SYBR Waikano Korewharewha:

I roto i te punaha tauhohenga PCR, ka taapirihia te taikaha o te waikano korikori SYBR.I muri i te whakaurunga kore-motuhake o te waikano rewharewha SYBR ki roto i te whenu-rua DNA, ka puta he tohu rewharewha.Ko te ngota waikano SYBR kaore i whakauruhia ki roto i te mekameka e kore e whakaputa i tetahi tohu rewharewha, na reira ka whakapumau i te tohu rewharewha Ko te pikinga o nga hua PCR ka tino tukutahi me te piki o nga hua PCR.Ko te SYBR anake e herea ana ki te DNA whenu-rua, na reira ka taea te whakamahi i te pihi rewa hei whakatau mena he mea motuhake te tauhohenga PCR.

3) Raro ngota:

He toronga oligonucleotide tapanga-rua-taakau ka hanga he anga makawe mo te 8 nga turanga i nga pito 5 me te 3.Ko nga raupapa waikawa karihi i nga pito e rua ka honoa, na te mea ka piri te roopu rekoata me te roopu tinei.Katia, karekau e puta te korakora.

I muri i te whakaputanga o te hua PCR, i te wa o te mahi whakaene, ka honoa te wahanga o waenganui o te ramarama rapoi ki tetahi raupapa DNA motuhake, a ka wehea te ira rewharewha mai i te ira tineia hei whakaputa i te rewharewha.

Ko nga tino kino o te PCR whakatipuranga tuarua:

Kei te ngaro tonu te tairongo, karekau i te tika te kitenga o nga tauira tauira iti.

Kei reira te awe o te uara papamuri, a ko te hua ka whakaraerae ki te pokanoa.

Ina he aukati PCR kei roto i te punaha tauhohenga, ka ngawari nga hua kitenga ki te pokanoa.

Whakatupuranga tuatoru PCR mamati

Ko te PCR Mamati (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) te tatau i te tau kape o te raupapa i whainga ma te rapunga ira-mutunga, ka taea te mahi i te rapunga ine tino tika me te kore e whakamahi i nga mana o roto me nga pihi paerewa.

Ka whakamahia e te PCR Mamati te rapunga mutunga, kaore i te whakawhirinaki ki te uara Ct (paepae huringa), na reira ka iti ake te paanga o te tauhohenga PCR matihiko e te kaha whakakaha, ka pai ake te manawanui ki nga aukati tauhohenga PCR, me te tino tika me te whakaputa.

Na nga ahuatanga o te tino aro nui me te tino tika, kaore i te ngawari ki te whakararu i nga aukati tauhohenga PCR, a ka taea e ia te whakatutuki i te ine tino pono kaore he hua paerewa, kua waiho hei rangahau me te hotspot tono.

E ai ki nga ahuatanga rereke o te waeine tauhohenga, ka taea te wehewehe kia toru nga momo matua: microfluidic, chip and droplet system.

1) PCR mamati microfluidic, mdPCR:

I runga i te hangarau microfluidic, ka wehea te tauira DNA.Ka taea e te hangarau microfluidic te mohio ki te tauira whakamohoatanga nano ranei te whakatipuranga o nga rūrūtia iti ake, engari me whai tikanga whakaurunga motuhake ka uru atu ki te punaha tauhohenga PCR.Kua tangohia te mdPCR e etahi atu tikanga whakakapi.

2) PCR mamati e ahu mai ana i te maturuturu, ddPCR:

Whakamahia te hangarau whakangao wai-in-hinu ki te tukatuka i te tauira ki roto i nga rūrūtia, ka wehea te punaha tauhohenga kei roto nga ngota ngota ngota karihi ki nga mano o nga rūpahu nanoscale, kei ia o enei kaore te ngota ngota waikawa karihi e kitea, kei roto ranei tetahi ki te maha o nga ngota ngota waikawa karihi hei whakamatautau.

3) PCR matihiko i runga maramara, cdPCR:

Whakamahia te hangarau huarahi wai whakauru ki te whakairo i te maha o nga microtubes me nga microcavities i runga i nga angiangi silicon, i te karaihe kiripaka ranei, me te whakahaere i te rere o te otinga i roto i nga momo mana whakahaere rereke, me te wehe i te tauira wai ki nga nanometers rite te rahi ki nga puna tauhohenga mo te PCR Reaction mamati ki te whakatutuki i te inenga tino.

Ko nga tino kino o te tuatoru o nga whakatipuranga PCR:

He utu nui nga taputapu me nga reagents.

He tiketike nga whakaritenga o te kounga tauira.Mena ka nui ake te rahinga tauira i te rahinga moroiti, kare e taea te tatau, a mena he iti rawa, ka heke te tika o te ine.

Ka taea hoki te whakaputa i nga hua pai inaa he whakakaha kore-motuhake.