I te mea he mea hou i roto i te taiwhanga, ehara i te mahi pai ki te tirotiro i nga tipu pai mai i te paihere o nga tipu he iti te tere o te hurihanga.Tuatahi, me tango te DNA mai i te maha o nga tauira takitahi, katahi ka kitea nga ira o waho e te PCR.Heoi, ko nga hua he watea me nga roopu me etahi mea iti i etahi wa, engari kaore e taea te whakatau mena kei te ngaro nga kitenga, nga kitenga teka ranei..He tino ngoikore ki te pa atu ki nga mahi whakamatautau me nga hua?Kaua e manukanuka, ma te tuakana koe e ako me pehea te tirotiro i nga tipu pai-whakawhitinga ngawari me te tika.

Hipanga 1

Tuhinga o mua hoahoa

Whakatauhia te ira mutunga me te ira o waho kia kitea i runga i te tauira ka whakamatauria, ka tohua he raupapa 100-500bp māngai i roto i te ira mo te hoahoa tuatahi.Ka taea e nga kaimatai pai te whakarite i te tika o nga hua rapunga me te whakapoto i te wa rapunga (tirohia te taapiri mo nga tohu tuatahi e whakamahia ana).

Panui: Me arotau nga ahuatanga o te tauhohenga me te manatoko i te tika, te tika me te tepenga kitea o te kitenga i mua i te kitenga nui.

Hipanga 2

Hoahoa kawa whakamatautau

Mana pai: Whakamahia te DNA kua purea kei roto te kongakonga i whaaia hei tauira hei whakatau mena he pai te punaha tauhohenga PCR me nga tikanga.

Mana kino/patea: Whakamahia te tauira DNA, te ddH2O ranei karekau te kongakonga whainga hei tauira kia kitea he puna poke kei roto i te punaha PCR.

Te mana tohutoro o roto: whakamahia te huinga tuatahi/torotoro o te ira mutunga o te tauira kia whakamatauria ki te arotake mena ka kitea te tauira e te PCR.

Panui:

Ko nga mana pai, kino/patea me nga mana whakahaere o roto me whakarite mo ia whakamatautau hei arotake i te mana o nga hua whakamatautau.

Te whakarite whakamatautau

I mua i te whakamahi, tirohia mehemea kua rite te ranunga o te otinga.Mena ka kitea he ua, me rewa me te konatunatua kia rite ki nga tohutohu i mua i te whakamahi.2×Ko te ranunga PCR me paipete me te konatunatua tonu ki te micropipette i mua i te whakamahi kia kore ai e rite te tohatoha katote.

Panui:

Tangohia te pukapuka ka panui marie, ka whakarite i mua i te whakamatautau kia rite ki nga whakaritenga o te pukapuka.

Hipanga 4

Whakaritehia te punaha tauhohenga PCR

E ai ki te kawa whakamatautau, whakaranuhia nga mea tuatahi, H2O, me te 2×PCR kia taurite te whakakotahi, te centrifuge ka tohatoha ki ia ngongo tauhohenga.

Panui:

Mo nga whakamatautau-nui, mo te wa-roa ranei, e taunaki ana kia whakamahia he punaha tauhohenga PCR kei roto ko te UNG enzyme, ka taea te karo i te poke aerosol na nga hua PCR.

Hipanga 5

Tāpiri tauira tauhohenga

Ma te whakamahi i te hangarau PCR Direct, kaore he take mo te purenga o te waikawa nucleic acid, ka taea te whakarite tauira tauira i roto i nga meneti 10, ka taea te taapiri i te punaha tauhohenga PCR.

Panui:

Ko te tikanga wehewehe he pai ake te paanga o te kitenga, a ka taea te whakamahi i te hua kua whiwhi mo nga tauhohenga kitenga maha.

5.1: Te roha tika o nga rau

E ai ki te rahi o te pikitia i roto i te pukapuka, tapahia te kiko rau me te diameter o te 2-3mm ka tuu ki te punaha tauhohenga PCR.

Tuhipoka: Me whakarite kia ruku katoa nga kongakonga rau ki roto i te otinga tauhohenga PCR, kaua hoki e tapiri he kiko rau.

5.2: Tikanga wehewehe rau

Tapahia te kiko rau me te diameter o te 5-7mm ka tuu ki roto i te ngongo centrifuge.Ki te whiriwhiri koe i nga rau pakeke, me karo i te whakamahi i nga kopa o te uaua matua o te rau.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ki roto i te ngongo centrifuge kia mohio ai ka taea e te lysate te tino rumaki i te kiko o te rau, ka waiho ki roto i te kaitarai waiariki, ki te pati whakarewa ranei, ka lysate i te 95°C mo te 5-10 meneti.

Taapirihia te 50ul Buffer P2 otinga whakakorenga ka uru pai.Ka taea te whakamahi i te lysate hei tauira me te taapiri atu ki te punaha tauhohenga PCR.

Tuhipoka: Ko te nui o te tauira kei waenganui i te 5-10% o te punaha PCR, kaua e neke ake i te 20% (hei tauira, i roto i te punaha PCR 20μl, taapirihia te 1-2μl o te otinga lysis, kaua e neke ake i te 4μl).

Hipanga 6

tauhohenga PCR

I muri i te centrifuging i te ngongo tauhohenga PCR, ka whakanohoia ki roto i te taputapu PCR hei whakanui ake.

Panui:

Ka whakamahia e te tauhohenga te tauira kore-pure mo te whakakaha, no reira ko te maha o nga huringa whakakaha he 5-10 atu huringa atu i te wa e whakamahi ana i te tauira DNA purea.

Hipanga 7

Te kimi hiko me te tātari hua

M: 100bp te arawhata DNA

1\4: Tikanga DNA purea

2\5: Tikanga PCR tika

3\6: Mana Putea

QC:

Ko nga hua whakamatautau o nga momo mana whakahaere i whakatakotohia i roto i te whakamatautau me tutuki nga tikanga e whai ake nei.Ki te kore, me tātarihia te take o te raru, me mahi ano te whakamatautau i muri i te whakakorenga o te raru.

Ripanga 1. Nga hua whakamatautau o nga momo roopu whakahaere

*I te wa e whakamahia ana te plasmid hei mana pai, ka kino te hua o te whakamatautau ira ira

Whakatau Whakatau:

A. He kino te hua whakamatautau o te ira endogenous o te tauira, e tohu ana ko te DNA e tika ana mo te kitenga PCR noa e kore e taea te tango mai i te tauira, kei roto ranei i te DNA kua tangohia nga aukati tauhohenga PCR, a me tango ano te DNA.

B. Ko te hua whakamatautau o te ira mutunga o te tauira he pai, he kino te hua whakamatautau o te ira o waho, e tohu ana ko te DNA e tika ana mo te kitenga PCR noa ka tangohia mai i te tauira, a ka taea te whakatau ko te ira XXX kaore i kitea i roto i te tauira.

C. He pai te hua whakamatautau o te ira mutunga o te tauira, a he pai te hua whakamatautau o te ira o waho, e tohu ana ko te DNA e tika ana mo te kitenga PCR noa kua tangohia mai i te tauira, kei roto i te tauira DNA te ira XXX.Ka taea ano nga whakamatautau whakamana.

Hipanga 8

Tuhinga o mua hoahoa

Whai muri i te whakamatautau, whakamahia te wairewa konutai hypochlorite 2% me te wairewa waihano 70% hei muru i te waahi whakamatautau kia kore ai e poke te taiao.