Tirohanga
Te tautuhi tere o nga tipu whakawhiti
Kuputuhi/Tong Yucheng
Mahi whakamatautau/Han Ying
Etita/Wen Youjun
Kupu/1600+
Te wa panui/8-10 meneti
Te tautuhi tere o nga tipu whakawhiti
I te mea he tauhou ki roto i te taiwhanga, ehara i te pai te mahi ki te tirotiro i nga tipu pai mai i te paihere o nga tipu he iti te tere o te hurihanga.Tuatahi, me tango te DNA mai i te maha o nga tauira takitahi, katahi ka kitea nga ira o waho e te PCR.Heoi, ko nga hua he watea me nga roopu me etahi mea iti i etahi wa, engari kaore e taea te whakatau mena kei te ngaro nga kitenga, nga kitenga teka ranei..He tino ngoikore ki te pa atu ki nga mahi whakamatautau me nga hua?Kaua e manukanuka, ma te tuakana koe e ako me pehea te tirotiro i nga tipu pai-whakawhitinga ngawari me te tika.
Hipanga 1: Tuhinga o mua hoahoa
Whakatauhia te ira mutunga me te ira o waho kia kitea i runga i te tauira ka whakamatauria, ka tohua he raupapa 100-500bp māngai i roto i te ira mo te hoahoa tuatahi.Ka taea e nga kaimatai pai te whakarite i te tika o nga hua rapunga me te whakapoto i te wa rapunga (tirohia te taapiri mo nga tohu tuatahi e whakamahia ana).
Tuhipoka:
Me arotau nga ahuatanga o te tauhohenga me te manatoko i te tika, te tika, me te tepe kitenga o te kitenga i mua i te mahi rapunga nui.
Hipanga 2:Whakawhanakehia te kawa whakamatautau
Mana pai: Whakamahia te DNA kua purea kei roto te kongakonga i whaaia hei tauira hei whakatau mena he pai te punaha tauhohenga PCR me nga tikanga.
Mana kino/patea: Whakamahia he tauira DNA, ddH ranei2O karekau i roto i te kongakonga whainga hei tauira ki te kite mena he puna poke kei roto i te punaha PCR.
Te mana tohutoro o roto: whakamahia te huinga tuatahi/torotoro o te ira mutunga o te tauira kia whakamatauria ki te arotake mena ka kitea te tauira e te PCR.
Tuhipoka:
Ko nga mana pai, kino/patea me nga mana whakahaere o roto me whakarite mo ia whakamatautau hei arotake i te mana o nga hua whakamatautau.
Hipanga 3: Te whakarite whakamatautau
I mua i te whakamahi, tirohia mehemea kua rite te ranunga o te otinga.Mena ka kitea he ua, me rewa me te konatunatua kia rite ki nga tohutohu i mua i te whakamahi.2×Ko te ranunga PCR me paipete me te konatunatua tonu ki te micropipette i mua i te whakamahi kia kore ai e rite te tohatoha katote.
Tuhipoka:
Tangohia nga tohutohu ka ata panuihia, ka whakarite i mua i te whakamatautau kia rite ki nga tohutohu.
Hipanga 4: Whakaritehia te punaha tauhohenga PCR
E ai ki te kawa whakamatautau, whakaranuhia nga mea tuatahi, H2O, 2×PCR ranunga, centrifuge me toha ki ia ngongo tauhohenga.
Tuhipoka:
Mo nga whakamatautau-nui, mo te wa-roa ranei, e taunaki ana kia whakamahia he punaha tauhohenga PCR kei roto ko te UNG enzyme, ka taea te karo i te poke aerosol na nga hua PCR.
Hipanga 5: Tāpiri tauira tauhohenga
Ma te whakamahi i te hangarau PCR Direct, kaore he take mo te mahi purenga waikawa nucleic acid.Ka taea te whakarite tauira tauira i roto i te 10 meneti ka taapiri atu ki te punaha tauhohenga PCR.
Tuhipoka:
Ko te tikanga Lysis he pai ake te paanga o te kitenga, a ka taea te whakamahi i te hua kua whiwhi mo nga tauhohenga kitenga maha.
5.1: PCR tika o nga rau
E ai ki te rahi o te pikitia i roto i te pukapuka, tapahia te kiko rau me te diameter o te 2-3mm ka tuu ki te punaha tauhohenga PCR.
Tuhipoka: Me whakarite kia ruku katoa nga kongakonga rau ki roto i te otinga tauhohenga PCR, kaua hoki e tapiri he kiko rau.
5.2: Tikanga lysis rau
Tapahia te kiko rau me te diameter o te 5-7mm ka tuu ki roto i te ngongo centrifuge.Ki te whiriwhiri koe i nga rau pakeke, me karo i te whakamahi i nga kopa o te uaua matua o te rau.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ki roto i te ngongo centrifuge kia mohio ai ka taea e te lysate te tino rumaki i te kiko o te rau, ka waiho ki roto i te kaitarai waiariki, ki te pati whakarewa ranei, ka lysate i te 95°C mo te 5-10 meneti.
Taapirihia te 50ul Buffer P2 otinga whakakorenga ka uru pai.Ka taea te whakamahi i te lysate hei tauira me te taapiri atu ki te punaha tauhohenga PCR.
Tuhipoka: Ko te nui o te tauira me noho i waenga i te 5-10% o te punaha PCR, kaua e neke ake i te 20% (hei tauira, i roto i te punaha PCR 20μl, taapirihia te 1-2μl o te lysis buffer, kaua e neke ake i te 4μl).
Hipanga 6: Tauhohenga PCR
Whai muri i te whakapoihanga i te ngongo tauhohenga PCR, tuu ki roto i te taputapu PCR hei whakakaha.
Tuhipoka:
Ka whakamahia e te tauhohenga te tauira kore-pure mo te whakakaha, no reira ko te maha o nga huringa whakakaha he 5-10 atu huringa atu i te wa e whakamahi ana i te tauira DNA purea.
Hipanga 7: Te kimi hiko me te tātari hua
M:100bp te arawhata DNA
1\4: Tikanga DNA purea
2\5: Tikanga PCR tika
3\6: Mana Putea
Mana Kounga:
Ko nga hua whakamatautau o nga momo mana whakahaere i whakatakotoria i roto i te whakamatautau me tutuki nga tikanga e whai ake nei.Ki te kore, me tātarihia te take o te raru, me mahi ano te whakamatautau i muri i te whakakorenga o te raru.
Ripanga 1. Nga hua whakamatautau o nga momo roopu whakahaere
*I te wa e whakamahia ana te plasmid hei mana pai, ka kino te hua o te whakamatautau ira ira
Whakatau Whakatau:
A. He kino te hua whakamatautau o te ira endogenous o te tauira, e tohu ana ko te DNA e tika ana mo te kitenga PCR noa e kore e taea te tango mai i te tauira, kei roto ranei i te DNA kua tangohia nga aukati tauhohenga PCR, a me tango ano te DNA.
B. Ko te hua whakamatautau o te ira mutunga o te tauira he pai, a he kino te hua whakamatautau o te ira o waho, e tohu ana ko te DNA e tika ana mo te kitenga PCR noa ka tangohia mai i te tauira, a ka taea te whakatau ko te ira XXX kaore i kitea i roto i te tauira.
C. He pai te hua whakamatautau o te ira mutunga o te tauira, a he pai te hua whakamatautau o te ira o waho, e tohu ana ko te DNA e tika ana mo te kitenga PCR noa kua tangohia mai i te tauira, kei roto i te tauira DNA te ira XXX.Ka taea ano nga whakamatautau whakamana.
Hipanga 8: Hoahoa tuatahi rapunga
Whai muri i te whakamatautau, whakamahia te wairewa konutai hypochlorite 2% me te wairewa waiwaro 70% hei muru i te waahi whakamatautau hei aukati i te parahanga taiao.
Apitihanga
Ripanga 2. Ko nga mea tuatahi e whakamahia ana mo te kitenga PCR whanui o nga tipu kua whakarereketia
Tuhinga tohutoro:
SN/T 1202-2010, Tikanga kimi PCR Kounga mo nga kai tipu ira i roto i te kai.
Panuitanga a te Manatu Ahuwhenua 1485-5-2010, Te whakamatautau i nga kai o nga tipu ira me o raatau hua-raihi M12 me ona hua.
Wā tuku: Hune-09-2021
