一, Whakanuia te tairongo o te punaha tauhohenga:

1. Wewetehia te RNA kounga teitei:

Ko te whakahiato cDNA angitu ka ahu mai i te RNA kounga teitei.Ko te RNA-kounga teitei me noho roa tonu me te kore he aukati transcriptase whakamuri penei i te EDTA, SDS ranei.Ko te kounga o te RNA ka whakatau i te nui rawa o nga korero raupapa ka taea e koe te tuhi ki te cDNA.Ko te tikanga purenga RNA noa he tikanga kotahi-taahiraa ma te whakamahi i te guanidine isothiocyanate / waikawa phenol.Hei aukati i te poke o te RNase, ko te RNA kua wehea mai i nga tauira whai rawa RNase (penei i te pancreas) me penapena ki roto i te formaldehyde hei pupuri i te RNA kounga teitei, ina koa mo te rokiroki mo te wa roa.Ko te RNA i tangohia mai i te ate kiore i tino whakahekehia i muri i te rongoa i roto i te wai mo te wiki kotahi, i te wa e mau tonu ana te RNA i tangohia mai i te kiko o te kiore whai muri i te penapena ki te wai mo te 3 tau.I tua atu, ko nga tuhinga roa ake i te 4 kb ka nui ake te aro ki te paheketanga e nga tohu RNases i nga tuhinga iti.Hei whakanui ake i te pumau o nga tauira RNA kua rongoa, ka taea te rewa te RNA ki roto i te formamide deionized ka rongoa ki te -70°C.Ko te Formamide i whakamahia hei tiaki i te RNA me noho kore he para whakakino RNA.Ko te RNA mai i te pancreas ka taea te pupuri i roto i te formamide mo te kotahi tau neke atu.I te wa e whakarite ana koe ki te whakamahi i te RNA, ka taea e koe te whakamahi i te tikanga e whai ake nei ki te whakaheke i te RNA: taapirihia te NaCl ki te 0.2M me te 4 nga wa o te rōrahi o te waihā, waiho ki te pāmahana rūma mo te 3-5 meneti, me te centrifuge i te 10,000xg mo te 5 meneti.

2. Whakamahia te RNaseH-inactive (RNaseH-) whakamuri transcriptase:

He maha nga wa ka taapirihia nga aukati RNase ki te whakamuri i nga tauhohenga whakawhiti hei whakanui ake i te roa me te tukunga o te cDNA synthesis.Me tapiri atu nga kaipatu RNase i te wa o te tauhohenga o te whenu tuatahi i te aroaro o te parepare me te kaihoko whakaheke (penei i te DTT), no te mea ko te tukanga i mua i te cDNA synthesis ka whakakore i te aukati, na reira ka tukuna te RNase herea ka taea te whakaheke i te RNA.Ko nga kaitautoko RNase Protein anake te aukati i te paheketanga o te RNA e te RNase A, B, C, me te kore e aukati i te RNase i runga i te kiri, na kia tupato kia kaua e whakauruhia te RNase mai i ou maihao ahakoa te whakamahi i enei aukati.

Ko te transcriptase whakamuri ka huri i te RNA ki te cDNA.Ko te M-MLV me te AMV he mahi RNaseH endogenous hei taapiri atu ki a raatau ake mahi polymerase.Ko te ngohe RNaseH me te ngohe polymerase e whakataetae ana tetahi ki tetahi mo te whenu ranu i hangaia i waenga i te tauira RNA me te whenu DNA tuatahi, cDNA toronga ranei, me te whakaheke i te whenu RNA i roto i te RNA:DNA complex.Ko te tauira RNA i whakahekehia e te mahi RNaseH ka kore e taea te mahi hei taputapu whai hua mo te whakahiato cDNA, e whakaiti ana i te hua me te roa o te whakahiato cDNA.Na reira, he pai ki te whakakore, ki te whakaiti ranei i te mahi RNaseH o te whakamuri transcriptase.

SuperScript Ⅱ whakamuri transcriptase, RNaseH- MMLV whakamuri transcriptase me thermoScript whakamuri transcriptase, RNaseH- AMV, ka taea te whiwhi moni nui ake me te cDNA roa-katoa atu i te MMLV me te AMV.Ko te tairongo RT-PCR ka pa ki te nui o te whakahiato cDNA.He tairongo ake te ThermoScript i te AMV.Ko te rahi o nga hua RT-PCR he iti na te kaha o te transcriptase whakamuri ki te whakahiato cDNA, ina koa ka kati nga cDNA nui ake.Ka whakatauritea ki te MMLV, SuperScripⅡ i tino piki ake te hua o nga hua RT-PCR roa.Ko te RNaseH-reverse transcriptase hoki kua piki ake te hauhautanga, no reira ka taea te mahi i te tauhohenga ki runga ake i te 37-42°C.I raro i nga tikanga whakahiato, whakamahia te oligo(dT) tuatahi me te 10 μCi o [α-P]dCTP.Ko te katoa o nga hua o te whenu tuatahi i tatauhia ma te whakamahi i te tikanga rerenga TCA.I wetewetehia te cDNA roa-katoa ma te whakamahi i nga roopu kua tohatohahia te rahi ka tangohia, ka tatauhia ki runga i te kaera kawakore.

3. Whakanuia te pāmahana heki mo te tuhi whakamuri:

Ko te teitei o te wera o te incubation ka awhina ki te whakatuwhera i te hanganga tuarua RNA, te whakanui ake i te hua o te tauhohenga.Mo te nuinga o nga tauira RNA, ko te whakamaarama i te RNA me nga mea tuatahi i te 65°C kaore he parepare, he tote ranei, ka whai i te whakamataonga tere i runga i te hukapapa ka whakakorea te nuinga o nga hanganga tuarua, ka taea te here i nga timatanga.Heoi ano, he hanganga tuarua tonu etahi tauira, ahakoa i muri i te whakahekenga wera.Ka taea te whakanui i enei tauira uaua ma te whakamahi i te ThermoScript Reverse Transcriptase me te whakanoho i te tauhohenga whakawhiti whakamuri ki te pāmahana teitei ake hei whakapai ake i te whakakaha.Ko te teitei ake o te whakamaarama incubation ka taea te whakanui ake i te motuhaketanga, ina koa ka whakamahia nga tohu tuatahi ira-motuhake (GSP) mo te whakahiato cDNA (tirohia te Upoko 3).Mēnā kei te whakamahi i te GSP, me whakarite kia rite te Tm o ngā pūmua ki te pāmahana heki e tūmanakohia ana.Kaua e whakamahi i te oligo(dT) me te matapōkere i runga ake i te 60°C.Ko nga mea timatanga matapōkere e hiahia ana kia heki i te 25°C mo te 10 meneti i mua i te piki ki te 60°C.I tua atu i te whakamahi i te pāmahana whakamuri whakamuri teitei ake, ka taea hoki te whakapai ake ma te whakawhiti tika i te ranunga RNA/primer mai i te 65°C denaturation pāmahana ki te whakamuri transcription incubation pāmahana me te tāpiri i te ranunga tauhohenga 2x whakamahana-mua (cDNA hot-start synthesis) .Ka awhina tenei huarahi ki te aukati i te tauruatanga o te turanga ipoipoi ka puta i te pāmahana iti.Ko te huringa pāmahana maha e hiahiatia ana mo te RT-PCR ka taea te whakangwari ma te whakamahi i te hiko hiko.

Tth thermostable polymerase hei DNA polymerase i te aroaro o Mg2+ me te RNA polymerase i te aroaro o Mn2+.Ka taea te whakamahana i te pāmahana teitei o te 65°C.Heoi, ko te noho mai o Mn2+ i te wa o te PCR ka whakaiti i te pono, ka iti ake te pai o te Tth polymerase mo te whakakaha tino tika, penei i te whakakoi o cDNA.I tua atu, he iti te kaha o te tuhi whakamuri o te Tth, e whakaiti ana i te aro, a, i te mea ka taea te mahi whakamuri me te PCR me te kotahi enzyme, kaore e taea te whakamahi i nga tauhohenga whakahaere kaore he whakawhitinga whakamuri hei whakataurite i nga hua whakakaha cDNA me te whakapoke i te DNA genomic.I wehea nga hua whakakaha.

4. Nga taapiri e whakatairanga ana i te tuhi whakamuri:

Ko nga taapiri tae atu ki te glycerol me te DMSO ka taapirihia ki te tauhohenga whakahiato o te whenu tuatahi, ka taea te whakaiti i te pumau o te whenu-rua waikawa nucleic me te wetewete i te hanganga tuarua o te RNA.Tae atu ki te 20% glycerol or 10% DMSO ka taea te taapiri me te kore e pa ki te mahi SuperScript II, MMLV ranei.Ka taea hoki e AMV te aro ki te 20% glycerol me te kore e ngaro te mahi.Hei whakanui ake i te tairongo o te RT-PCR i roto i te SuperScriptⅡ whakamuri tauhohenga whakawhiti, 10% glycerol ka taea te taapiri me te incubated i te 45°C.Mena ka taapirihia te 1/10 o te hua tauhohenga whakamuri ki te PCR, ko te kukū o te glycerol i roto i te tauhohenga whakakaha he 0.4%, kaore e ranea ki te aukati i te PCR.

5. RNaseH maimoatanga:

Ko te maimoatanga o nga tauhohenga whakahiato cDNA me te RNaseH i mua i te PCR ka taea te whakanui ake i te tairongo.Mo etahi tauira, ko te whakaaro ko te RNA i roto i te tauhohenga whakahiato cDNA ka aukati i te herenga o nga hua whakakaha, ka taea e te maimoatanga RNaseH te whakanui ake i te tairongo.Ko te tikanga, me tika te maimoatanga RNaseH ina whakakaha ake i nga tauira whainga cDNA roa-katoa, penei i te iti-kopi tuberous scherosis II.Mo tenei tauira uaua, ka whakareihia e te maimoatanga RNaseH te tohu i hangaia e SuperScript II, AMV-synthesized cDNA ranei.Mo te nuinga o nga tauhohenga RT-PCR, he mea whiriwhiri te maimoatanga RNaseH, na te mea ko te hikoi denaturation PCR i te 95°C i te nuinga o te waa ka whakamaarama i te RNA i roto i te RNA:DNA matatini.

6. Whakapai ake i te Tikanga Tirohanga RNA Iti:

He tino wero te RT-PCR ina he iti noa te RNA e waatea ana.Ko te Glycogen hei kaikawe i te wa e wehe ana te RNA ka awhina ki te whakanui ake i nga hua o nga tauira iti.Ka taea te taapiri i te glycogen RNase-kore i te wa ano me te taapiri i te Trizol.Ko te Glycogen he wairewa te wai, ka taea te pupuri i roto i te wahanga wai me te RNA hei awhina i te rerenga o muri mai.Mo nga tauira iti iho i te 50 mg o te kiko, 106 ranei nga pūtau ahurea, ko te kukū o te glycogen RNase-kore he 250 μg/ml.

Ko te taapiri i te BSA acetylated ki te tauhohenga whakawhiti whakamuri ma te whakamahi i te SuperScript II ka taea te whakanui ake i te maarama, a, mo te iti o te RNA, ka whakaitihia te nui o te SuperScript II me te taapiri i nga waeine 40 o te RNaseOut nuclease inhibitor ka taea te whakanui ake i te taumata o te kitenga.Mena ka whakamahia te glycogen i roto i te tukanga wehenga RNA, ka tūtohu tonu kia taapirihia te BSA, RNase inhibitor ranei ina whakamahi ana i te SuperScript II mo te tauhohenga whakawhiti whakamuri.

二, Whakanuia te motuhake RT-PCR

1. CND Whakakotahitanga:

Ka taea te timata te whakahiatotanga cDNA tuatahi ma te whakamahi i nga tikanga rereke e toru, ko te ahua motuhake o enei e pa ana ki te nui me te momo cDNA kua whakahiatotia.

Ko te tikanga tuatahi matapōkere te mea iti rawa o nga tikanga e toru.Ka whakahiatohia e nga papa tuatahi ki nga waahi maha puta noa i te tuhinga, ka whakaputa i nga cDNA poto, waahanga-roa.Ka whakamahia tenei tikanga ki te whiwhi i nga raupapa mutunga 5′ me te whiwhi cDNA mai i nga tauira RNA me nga rohe o te hanganga tuarua, me nga waahi whakamutu ranei e kore e taea te whakahoki e te transcriptase whakamuri.Ki te whiwhi i te cDNA roa rawa atu, me whakatau te tauwehenga o nga timatanga ki te RNA i ia tauira RNA me whakatau i nga tikanga.Ko te kukū tuatahi o nga matapōkere tuatahi mai i te 50 ki te 250 ng ia 20 μl tauhohenga.I te mea ko te cDNA i whakahiato mai i te tapeke RNA ma te whakamahi i nga papaamata matapōkere ko te RNA ribosomal te tuatahi, ko te poly(A)+RNA ka tohua hei tauira.

He mea motuhake ake nga mea tuatahi o Oligo(dT) i nga mea tuatahi matapōkere.Ka whakakotahi ki te hiku poly(A) ka kitea i te pito 3′ o te nuinga o nga mRNA eukaryotic.No te mea ko te poly(A)+ RNA he tata ki te 1% ki te 2% o te katoa o te RNA, he iti ake te nui me te uaua o te cDNA i nga timatanga matapōkere.Na tona tino motuhake, karekau te oligo(dT) e rapu arotautanga o te ōwehenga o te RNA ki nga mea tuatahi me te kowhiringa poly(A)+.E taunaki ana kia whakamahia te 0.5μg oligo(dT) ia 20μl pūnaha tauhohenga.Ko te oligo(dT)12-18 he pai mo te nuinga o te RT-PCR.Ko te Pūnaha ThermoScript RT-PCR he oligo(dT)20 na te mea he pai ake te pumau o te waiariki mo te teitei ake o te mahana heki.

Ko nga tohu tuatahi ira (GSP) ko nga tohu tuatahi mo te taahiraa whakawhiti whakamuri.Ko te GSP he oligonucleotide antisense ka taea te whakakotahi ki te raupapa whaainga RNA, kaore i rite ki nga timatanga matapōkere, oligo(dT), ka hono ki nga RNA katoa.Ko nga ture ano e whakamahia ana ki te hoahoa tuatahi PCR e pa ana ki te hoahoa o te GSP i roto i nga tauhohenga whakawhiti whakamuri.Ko te GSP he rite tonu te raupapa ki te tuatahi whakakaha e hono ana ki te 3'-te nuinga o te mutunga o te mRNA, ka taea ranei te GSP te hoahoa ki te whakangao i te awa o te tuatahi whakamuri whakakaha.Mo etahi marau kua whakakaha ake, me hoahoa kia nui ake i te kotahi te reanga antisense mo te RT-PCR angitu na te mea ko te hanganga tuarua o te RNA whainga ka aukati i te here tuatahi.E taunaki ana kia whakamahia te 1 pmol antisense GSP i roto i te 20 μl tauhohenga whakahiato tuatahi.

2. Whakanuia te pāmahana heki mo te tuhi whakamuri:

Kia pai ai te tino painga o te motuhake o te GSP, me whakamahi he transcriptase whakamuri me te teitei ake o te hauhautanga.Ka taea te whakamau i nga whakamaarama whakamuri te whakamaarama ki te whakanui ake i te kaha o te tauhohenga.Hei tauira, ki te whakahiato te GSP ki te 55°C, e kore e tino whakamahia te motuhake o te GSP mena ka whakamahia te AMV, M-MLV ranei mo te tuhi whakamuri i te herenga iti o te 37°C.Engari, ko te SuperScript II me te ThermoScript ka taea te tauhohe i te 50°C teitei ake ranei, ka whakakorea nga hua kore-motuhake i hangaia i nga wera iti.Mo te tino motuhake, ka taea te whakawhiti tika te ranunga RNA/primer mai i te 65°C denaturation pāmahana ki te whakamuri transcription incubation pāmahana me te tāpiri ki te 2x ranunga tauhohenga i mua-mahana (cDNA synthesis wera tīmatanga).Ka awhina tenei ki te aukati i te tauruatanga o te turanga i waenga i nga ngota i te pāmahana iti.Ko nga whakawhitinga pāmahana maha e hiahiatia ana mo te RT-PCR ka taea te whakamaarama ma te whakamahi i te hiko hiko.

3. Ka whakaiti i te poke DNA ira tangata:

Ko te raru pea ka pa ki te RT-PCR ko te poke o te DNA genomic i te RNA.Ma te whakamahi i te tikanga wehe RNA pai, penei i te Trizol Reagent, ka whakaiti i te nui o te DNA genomic e whakapoke ana i te whakaritenga RNA.Hei karo i nga hua i ahu mai i te DNA genomic, ka taea te rongoa RNA ki te DNase I-whakakaha hei tango i te DNA poke i mua i te whakamuri i te tuhi.I whakamutua te nakunaku DNase I ma te whakawhao i nga tauira ki te 2.0 mM EDTA mo te 10 meneti i te 65°C.Ka taea e te EDTA te tarai i nga katote konupora, te aukati i te RNA hydrolysis o te katote konupora i te wera nui.

Hei wehe i te cDNA whakakaha mai i te whakakino i nga hua whakakaha DNA ira tangata, ka taea te hanga i nga mea tuatahi kia whakahiatohia ia ki te wehe i nga exons.Ko nga hua PCR i ahu mai i te cDNA ka poto ake i era i ahu mai i te DNA ira tangata pokea.I tua atu, i mahia he whakamatautau mana me te kore tuhi whakamuri i runga i ia tauira RNA hei whakatau mena i ahu mai tetahi kongakonga i te DNA genomic, cDNA ranei.Ko te hua PCR kaore he tuhinga whakamuri i ahu mai i te genome.