1. Te matauranga taketake (mehemea kei te pirangi koe ki te kite i te waahanga whakamatautau, me whakawhiti tika ki te waahanga tuarua)
Ka rite ki te tauhohenga pärönaki o PCR tikanga, te nuinga aroturuki PCR wā Real te huringa o te nui o te hua whakakaha i roto i ia huringa o te tauhohenga PCR amplification i roto i te wā tūturu i roto i te huringa o te tohu fluorescence, me te tātari ine i te tauira timata i roto i te hononga i waenganui i te uara ct me te ānau paerewa .
Ko nga raraunga motuhake o te RT-PCR koturanga, paepae fluorescenceaUara Ct.
| turanga: | Ko te uara o te rewharewha o te huringa 3-15th ko te papa (baseline), na te hapa o te ine i etahi wa. |
| Paepae (paepae): | E tohu ana ki te tepe rapunga rewharewha kua tautuhia ki te tuunga e tika ana i roto i te rohe tipu taupuke o te ānau whakakaha, ko te tikanga 10 nga wa te inenga paerewa o te rarangi turanga. |
| Uara CT: | Koia te maha o nga huringa PCR ina tae te uara o te rewharewha o ia ngongo tauhohenga ki te paepae. Ko te uara Ct he taurite ki te nui o te tauira tuatahi. |
Nga tikanga tapanga noa mo RT-PCR:
| tikanga | painga | ngoikoretanga | te whānuitanga o te tono |
| SYBR GreenⅠ | Whānui tono, tairongo, cheap me te watea | He tiketike nga whakaritenga tuatahi, he pai ki nga roopu kore-motuhake | He pai mo te wetewete ine ine o nga momo ira, rangahau mo te whakaaturanga ira, me te rangahau mo nga kararehe me nga tipu whakawhiti. |
| TaqMan | He pai te motuhake me te tukurua teitei | He nui te utu, he pai anake mo nga whaainga motuhake. | Te kitenga o te mate, te rangahau ira aatete ki te tarukino, te aromatawai i te kaha o te tarukino, te tātaritanga o nga mate ira. |
| ramaroa ngota | Te motuhake teitei, te maramara, te papamuri iti | He nui te utu, he mea tika mo tetahi kaupapa motuhake, he uaua te hoahoa, he nui te utu. | Te tātari ira motuhake, te tātari SNP |
2. Nga mahi whakamatautau
2.1 Mo te whakarōpūtanga whakamatautau- me maha nga puna i roto i te roopu, me te tukuruatanga koiora.
| ① | Mana whakahaere | Ka whakamahia ki te kite i te mana tipu o nga pūtau i roto i nga whakamatautau |
| ② | SiRNA mana toraro (raupapa siRNA kore-motuhake) | Whakaatuhia te motuhake o te mahi RNAi.Ka taea e te siRNA te whakahoki urupare kore-motuhake i te kukū o te 200nM. |
| ③ | Whakawhiti Reagent Mana | Waiho te paitini o te tauhohenga whakawhiti ki nga pūtau, te paanga ranei ki te whakaaturanga o te ira i whai |
| ④ | siRNA ki te ira ira | Patua ki raro te whakapuakitanga o te ira i whäia |
| ⑤ (kōwhiringa) | siRNA pai | Ka whakamahia ki te raru i te punaha whakamatautau me nga raru whakahaere |
| ⑥ (kōwhiringa) | Te mana korikori siRNA | Ka taea te kite i te kaha o te whakawhiti pūtau ki te karuiti |
2.2 Nga tikanga o te hoahoa tuatahi
| Te rahi o te kongakonga kua whakanuia | He pai ake i te 100-150bp |
| Te Roa Tuatahi | 18-25bp |
| ihirangi GC | 30%-70%, pai ake 45%-55% |
| Tm uara | 58-60 ℃ |
| Raupapa | A ape i T/C tonu;A/G tonu |
| 3 raupapa mutunga | A ape i GC taonga AT taonga ranei;ko te turanga kapeka he G ko C ranei;he pai ki te karo i a T |
| Whakakotahitanga | A ape i nga raupapa taapiri kia neke atu i te 3 nga turanga i roto i te tuatahi, i waenga ranei i nga papa tuatahi e rua |
| Te motuhake | Whakamahia te rapu pupuhi ki te whakaū i te motuhake tuatahi |
①SiRNA he momo-motuhake, a ka rereke nga raupapa o nga momo momo rereke.
②Ko te SiRNA kua takai ki roto i te paura maroke-tio, ka taea te rongoa mo te 2-4 wiki i te pāmahana rūma.
2.3 Nga taputapu me nga reagents me whakarite i mua
| Primer (tohutoro o roto) | Tae atu ki mua me te whakamuri e rua |
| Primers (ira whainga) | Tae atu ki mua me te whakamuri e rua |
| Whāinga Si RNA (3 tāhei) | Ko te tikanga, ka whakahiatotia e te kamupene nga taakaa e 3, katahi ka kowhiria tetahi o te toru ma te RT-PCR |
| Kete Whakawhiti | Lipo2000 etc. |
| Kete Tangohanga Tere RNA | Mo te tangohanga RNA i muri i te whakawhitinga |
| Kete Whakamuri Whakamuri Tere | mo te whakahiato cDNA |
| Kete Whakanui PCR | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Mo nga take e tika ana kia arohia i roto i nga waahanga whakamatautau motuhake:
①siRNA tukanga whakawhiti
1. Mo te whakakikorua, ka taea e koe te whiriwhiri pereti 24-puna, pereti 12-puna, pereti 6-puna ranei (ko te kuhanga RNA toharite e whakaarohia ana i ia puna o te pereti 24-puna he 100-300 ng/uL), me te tino pai o te whakawhitinga whakawhiti o nga pūtau ki runga ki te 60 % -80% neke atu ranei
2. Ko nga taahiraa whakawhiti me nga whakaritenga motuhake e tino rite ana ki nga tohutohu.
3. I muri i te whakawhitinga, ka taea te kohia nga tauira i roto i nga haora 24-72 mo te kitenga mRNA (RT-PCR) me te kitenga pūmua i roto i nga haora 48-96 (WB)
② Te tukanga tangohanga RNA
1. Aukati i te pokenga e nga enzymes o waho.Kei roto i te nuinga o te waa te mau kanohi kanohi me nga karapu;te whakamahi i nga tohutohu paipa me nga ngongo EP;Ko te wai i whakamahia i roto i te whakamatautau me RNase-Kore.
2. E taunaki ana kia rua nga wa e whakaarohia ana i roto i te kete tangohanga tere, ka tino pai ake te ma me te hua.
3. Kaua te wai para e pa ki te pou RNA.
③ Te inenga RNA
I muri i te tangohanga o te RNA, ka taea te tatau tika ki a Nanodrop , me te iti o te panui ka taea te iti ki te 10ng / ul.
④Whakamuri te tukanga tuhi
1. Na te kaha o te tairongo o RT-qPCR, me hanga kia 3 nga puna whakarara mo ia tauira kia kore ai e rerekee te Ct o muri mai, kia nui rawa ranei te SD mo te tātari tauanga.
2. Kaua e whakatio me te whakamaroke i te ranunga Kaiwhakaako.
3. Me whakakapi ia ngongo/poka ki te pito hou!Kaua e whakamahi tonu i te pito paipa hei taapiri tauira!
4. Ko te kiriata e piri ana ki te pereti 96-poka i muri i te taapiri i te tauira me whakaene ki te pereti.He pai ake te centrifuge i mua i te tuu ki runga i te miihini, kia rere te wai o te pakitara ngongo ki raro ka tango i nga mirumiru hau.
⑤Ko te tātari ānau noa
| Karekau he wa o te tipu arorau | Te kukū nui pea o te tauira |
| Kore he uara CT | Ko nga hikoinga he mo te kimi i nga tohu rewharewha; te paheketanga o nga mea tuatahi me nga rangahau - ka kitea tona tika ma te PAGE electrophoresis; iti rawa te rahi o te tauira; te paheketanga o nga tauira - te karo i te whakaurunga o nga poke me te whakatotoi me te rewa i roto i te whakarite tauira; |
| Ct>38 | He iti te kaha o te whakakaha;He roa rawa te hua PCR;ka whakahekehia nga momo tauhohenga |
| Anau whakakaha raina | Ka taea te whakaheke i tetahi waahanga o nga whakamatautau ma te tukurua o nga huringa whakatio-rewa, ki te wa roa ranei ki te marama |
| He tino nui te rereketanga o nga rua takirua | Ko te otinga tauhohenga kaore i te tino rewa, karekau ranei i konatunatua te otinga tauhohenga;ko te pati waiariki o te taputapu PCR kua poke i nga matū korikori |
2.5 Mo te tātari raraunga
Ko te tātaritanga raraunga o te qPCR ka taea te wehewehe ki te inenga whanaunga me te ine tino.Hei tauira, nga pūtau o te roopu maimoatanga ka whakatauritea ki nga pūtau o te roopu whakahaere,
E hia nga wa ka huri te mRNA o te ira X, he inenga whanaunga tenei;i roto i te maha o nga pūtau, te mRNA o te ira X
E hia nga kape kei reira, he inenga tuturu tenei.I te nuinga o te waa ko nga mea e whakamahia ana e matou i roto i te taiwhanga ko te tikanga ine ine.Ko te tikanga,te tikanga 2-ΔΔctKa whakamahia te nuinga i roto i nga whakamatautau, na ko tenei tikanga anake ka whakaurua ki konei.
Tikanga 2-ΔΔct: Ko te hua ka puta ko te rereketanga o te whakapuakitanga o te ira ira i roto i te roopu whakamatautau e pa ana ki te ira whaainga i roto i te roopu whakahaere.E tika ana kia tata ki te 100% te kaha whakakaha o te ira whainga me te ira tohutoro o roto, a kaua e neke ake i te 5%.
Ko te tikanga tatauranga e whai ake nei:
Δct rōpū whakahaere = ct uara o te ira whai i roto i te rōpū whakahaere – ct uara o roto tohutoro ira i roto i te rōpū whakahaere
Δct rōpū whakamātautau = ct uara o te ira whainga i roto i te roopu whakamatautau - ct uara o te ira tohutoro o roto i te roopu whakamatautau
ΔΔct = Δct rōpū whakamātautau-Δct rōpū whakahaere
Ka mutu, tātaihia te maha o te rerekētanga o te taumata kīanga:
Huri Kopa=2-ΔΔct (e rite ana ki te mahi Excel ko POWER)
Hua e pā ana:
Te wa tuku: Mei-20-2023
