Kaore e taea e nga tuhinga whakamuri tawhito te aro ki nga wera nui (ko te pāmahana tino pai mo te mahi MMLV ko te 37-50 ° C, me te AMV ko 42-60 ° C).Ko te RNA viral uaua ake e kore e taea te whakahoki tika ki te tuhi ki te cDNA i te iti o te mahana, ka whai hua te rapunga Te whakahekenga.Ko te tikanga o te RT-qPCR tuku iho ko te whai waahi o nga whaariki matua e rua (whakamuri transcriptase me te DNA polymerase), e kore ai e taea te whakangawari i te mahi o te punaha tauhohenga me te whakaheke i te utu.I konei ka whakaurua e matou nga tuhinga whakamuri e rua-te-te-te-mahana-nui, TtH me RevTaq.Ko enei enzyme e rua ano te mahi a te DNA polymerase, no reira ka kiia ko nga enzyme bifunctional.

TtH DNA polymerase

Kua rongo pea koe mo TtH, i ahu mai i te huakita thermophilic Thermus thermophilus HB8.I te aroaro o nga cation divalent penei i te Mg2+, he mahi polymerase DNA.Ka whakamahia nuitia i roto i nga tauhohenga PCR penei i te Taq enzyme, engari he teitei ake te parenga wera i te Taq enzyme, na reira he pai ake te paanga ki te PCR me nga tauira ihirangi GC teitei.

· Karekau he mahi exonuclease 3′→5′ me te 5′→3′ mahi exonuclease, no reira ka taea hoki te whakamahi mo te raupapatanga dideoxy.

· He mahi RTase tenei enzyme.I te aroaro o Mn2 +, ka whakanuia te mahi RTase.Ma te whakamahi i tenei ahuatanga, ka taea te whakamahi ki te mahi i te tauhohenga whakawhiti whakamuri me te tauhohenga PCR i roto i te ngongo kotahi, ara, kotahi-taahiraa RT-PCR.Engari, i te aroaro o Mn2 +, kaore i te teitei te tika o te RT-PCR.Karekau he mahi a te mahi RT ki te mahi rnaase H.

· Ko te kaha ake o te mahi o te Tth-DNA polymerase (pH9, tino pai +55℃～+70℃, mōrahi +95℃) ka hinga i nga raruraru na te hanganga tuarua o te RNA.Ko te cDNA ka puta ka taea te whakanui i te PCR me te rite tonu o te enzyme i te aroaro o nga katote Mg2+.

· Ko te kaha o te Tth-DNA polymerase ki te mahi i te whakawhitinga whakamuri me te whakanui i te DNA i nga wera nui ka whai hua tenei enzyme mo te RT-PCR ine, ki te whakamaarama, me te tātari whakaaturanga ira o te RNA pūtau me te huaketo.
· Ka whakamahia te Tth-DNA polymerase mo te RT-PCR hei whakanui ake i te RNA ki te 1kb.

Nga ahuatanga me nga painga

Tth DNA polymerase:

• Me whakarite te rahinga hua o te tauhohenga mekameka polymerase (PCR), i te iti rawa 1000 bp i te tauhohenga RT-PCR

• Whakaaetia te deoxyribonucleoside triphosphate kua whakarereketia hei tïpako

• Kaore e pa ana ki te mahi RNase H

• He teitei te waiariki hei whakaea i nga raruraru, ko te tikanga e pa ana ki te hanganga tuarua teitei kei roto i te RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

He polymerase DNA wera-wera me te mahi whakamuri transcriptase

Ko te RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase he mea hangai, he tino wera-wera, he mahi-rua-rua me te whakamuri transcriptase me nga mahi DNA polymerase i whiwhi mai i te kunenga mai me te kukuwhatanga.

· Ko te haurua o te ora o RevTaq RT-PCR DNA polymerase i te 95°C he nui ake i te 40 meneti.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase ka taea te whakamaoritanga whakamuri o te wera nui mai i te tauira RNA, a ka taea te tukurua i te taahiraa whakamuri i nga wa maha ki te whakaputa tauira cDNA.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase ka taea te "zero-step" RT-PCR (karekau he hikoi whakamuri whakamuri), na te mea i roto i te takahanga toronga PCR hurihanga, ka puta te whakawhitinga whakamuri me te whakakaha DNA i te wa kotahi.Ka whakatairanga hoki tenei i te tauhohenga whakawhiti whakamuri i nga wera nui, na reira ka whakaiti i nga raru e pa ana ki te whakarewa i te hanganga tuarua kaha i roto i te RNA i nga wera nui.

· Nā te tātai wera-tīmata-aptamer-a-aptamer, ka puta ake nga hua pai ake a RevTaq RT-PCR DNA polymerase ina teitei ake te mahana whakaene me te toronga i te 57°C.

· I te mea he wera-wera te enzyme, e taunaki ana kia hoahoa i nga kaupapa tuatahi me nga rangahau me nga tohu whakarewa teitei (>60°C).

· E taunaki ana kia arotauhia te pāmahana o te hikoi whakaene/ toronga i roto i te rōnaki pāmahana i roto i te tukanga tatūnga tauhohenga.

· Ko te teitei o te pāmahana, ko te teitei ake o te motuhake o te PCR.Ko te huringa whakawhiti whakamuri ka mahia i te pāmahana teitei ake i te huringa PCR, na te mea ko te DNA Primer:RNA Template hybridization he teitei ake te ira whakarewa ake i te DNA Primer:cDNA Template duplex.

· Ko RevTaq RT-PCR DNA polymerase he mea hanga ira me te arotau, a ko te rahi o te amplicon kei waenga i te 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA polymerase tetepenga kitea kia 4 kape/

Ko te punaha tauhohenga tino arotau (te whakaturanga o nga tohu whakarewa teitei) e whakaatuhia ana i te ahua.Ko te RevTaq RT-PCR DNA polymerase-driven RT-PCR e whakaatu ana i te tairongo pai ake i te TaqPath 1-step RT-qPCR master mix, me te iti o te kitenga Rōnaki waimeha tauira.

Ētahi atu painga:

Te mahi timata tere → Ka taea te peke i te hikoi whakawera waiariki tuatahi.

Te tātai aptamer tīmata wera → Whakaratohia kia 100% te mahi whākōkī i te wā tonu me te aukati i te whakakaha kore-motuhake i te pāmahana iti (<57°C).

Te mahi wehewehe → Ka waihohia te taahiraa tangohanga RNA, na te mea ka taea e RevTaq RT-PCR DNA polymerase te tukatuka i nga tauira tauhohenga kino.Ka taea e ia te whakangaro i nga kiriuhi pūtau o te eukaryotes, te huakita me nga huaketo i roto i te huringa RT-PCR wera.

IVD taumata rauemi mata → paerewa kounga teitei me nga utu tino whakataetae