• Ko te PCR he tikanga hei whakanui i te DNA mai i te iti o te tauira DNA.Ka whakamahi te RT-PCR i te tuhi whakamuri ki te whakaputa tauira DNA mai i te puna RNA ka taea te whakanui ake.
• Ko te PCR me te RT-PCR he tauhohenga mutunga, engari ko te qPCR me te RT-qPCR e whakamahi ana i nga kinetics o te tere o te whakahiato hua i te wa o te tauhohenga PCR ki te ine i te nui o te tauira kei reira.
• Ko nga tikanga hou, penei i te PCR matihiko, e whakarato ana i te inenga tino o te tauira DNA tuatahi, engari ko nga tikanga penei i te PCR hauhauariki ka whakaiti i te hiahia mo nga taputapu utu nui hei whakarato i nga hua pono.

Ko te tauhohenga mekameka polymerase (PCR) he tikanga ngawari me te whakamahi whanui i te tikanga koiora irapoi hei whakanui me te kite i nga raupapa DNA me te RNA.Ka whakatauritea ki nga tikanga tuku iho mo te whakakao DNA me te whakakaha, he maha nga ra ka roa, he iti noa nga haora e hiahiatia ana e te PCR.He tino tairongo te PCR me te iti o te tauira mo te kimi me te whakakaha i nga raupapatanga motuhake.Ko nga tikanga PCR taketake kua piki ake mai i te DNA ngawari me te rapunga RNA.Kei raro nei, kua whakaratohia e matou he tirohanga whanui mo nga tikanga PCR rereke me nga reagents e whakaratohia ana e matou i Enzo Life Sciences mo o hiahia rangahau.E whai ana matou ki te awhina i nga kaiputaiao ki te uru tere ki nga reagents PCR hei whakamahi i a raatau kaupapa rangahau e whai ake nei!

PCR

Mo te PCR paerewa, ko nga mea katoa e hiahia ana koe he DNA polymerase, konupora, nucleotides, primers, te tauira DNA hei whakanui ake, me te thermocycler.He ngawari noa te hangahanga PCR penei i tana kaupapa: 1) Ko te DNA whenu-rua (dsDNA) ka whakaheke i te wera, 2) ka hono nga mea tuatahi ki nga whenu DNA kotahi, me te 3) ka whakaroahia nga mea tuatahi e te DNA polymerase, ka puta mai e rua nga kape o te whenu DNA taketake.Ko te tukanga denaturation, annealing, me te whakaroa i runga i te raupapa o te mahana me te wa e mohiotia ana ko te huringa kotahi o te whakanui (Fig. 1).

Ko ia taahiraa o te huringa me arotau mo te tauira me te huinga tuatahi i whakamahia.Ka tuaruatia tenei huringa tata ki te 20-40 nga wa, katahi ka taea te wetewete i te hua kua whakanuia, ko te tikanga ma te kara kiaose (Fig. 2).

I te mea he tikanga tino tairongo te PCR, he iti rawa nga pukapuka e hiahiatia ana mo nga tauhohenga kotahi, ka tūtohuhia te whakarite i tetahi ranunga matua mo nga tauhohenga maha.Me pai te whakaranu i te ranunga matua, katahi ka wehea e te maha o nga tauhohenga, me te whakarite kia rite te nui o te whaariki, dNTP, me nga mea tuatahi ki ia tauhohenga.He maha nga kaiwhakarato, penei i te Enzo Life Sciences, e tuku ana i nga ranunga PCR kei roto i nga mea katoa engari ko nga mea tuatahi me te tauira DNA.

Ko nga rohe o Guanine/Cytosine-taonga (GC-taonga) he wero i roto i nga tikanga PCR paerewa.Ko nga raupapa taonga-GC he pai ake i nga raupapa he iti ake te ihirangi GC.I tua atu, ko nga raupapa taonga-GC ka hanga i nga hanganga tuarua, penei i nga koropiko makawe.Ko te mutunga mai, he uaua ki te wehe katoa nga whenu-nui ki te GC i roto i te wahanga denaturation.No reira, kaore e taea e te DNA polymerase te whakahiato i te whenu hou me te kore e aukati.Ka taea te whakapai ake i te pāmahana whakahekenga teitei ake, ka taea e te whakarereketanga ki te teitei ake o te pāmahana whakaenee me te poto o te wa whakaeneene ka aukati i te herenga kore e tauwhāitihia o nga kaimatai-a-GC.Ka taea e etahi atu reagents te whakarei ake i te whakakaha o nga raupapatanga taonga-GC.Ko te DMSO, te glycerol, me te betaine ka awhina ki te whakararu i nga hanganga tuarua e puta mai ana i nga taunekeneke GC, na reira ka awhina i te wehenga o nga whenu takirua.

Hot Start PCR

Ko te whakakaha kore motuhake he raruraru ka puta i te wa PCR.Ko te nuinga o nga polymerases DNA e whakamahia ana mo te PCR he pai te mahi i te mahana i te 68°C ki te 72°C.Ka taea e te enzyme, engari, ka kaha hoki i nga wera iti, ahakoa ki te iti ake.I te pāmahana kei raro rawa atu i te pāmahana whakaene, ka taea e nga papa tuatahi te here kore-motuhake me te arahi ki te whakakaha kore-motuhake, ahakoa kua whakaritea te tauhohenga ki runga tio.Ka taea te aukati i tenei ma te whakamahi i nga aukati polymerase ka wehe mai i te DNA polymerase kia tae noa ki tetahi pāmahana, no reira te kupu PCR timata wera.Ko te aukati he antibody e herea ana te polymerase me te denatures i te pāmahana denaturation tuatahi (95°C te tikanga).

Polymerase Pono Nui

Ahakoa he tika te whakanui i nga polymerases DNA ki te raupapa tauira taketake, ka puta he hapa i roto i te taurite nucleotide.Ko te kore e rite ana ki nga tono penei i te katote ka hua mai nga tuhinga kua poroa, ka he te whakamaoritanga, te koretake ranei o nga pūmua ki raro.Hei karo i enei koretake, kua tautuhia nga polymerases me te mahi "whakatikatika" me te whakauru ki te rerenga mahi.Ko te polymerase panui tuatahi, ko Pfu, i kitea i te tau 1991 i Pyrococcus furiosus.He 3' ki te 5' te mahi exonuclease tenei enzyme Pfu.I te wa e whakanuia ana te DNA, ka tangohia e te exonuclease nga nucleotides i te pito 3' o te whenu.Ka whakakapihia te nucleotide tika, ka haere tonu te whakahiato DNA.Ko te tautuhi i nga raupapa nucleotide he i runga i te hononga hono mo te nucleoside triphosphate tika me te enzyme, i te mea kaore e pai te herenga ka whakaroa i te whakahiatotanga ka taea te whakakapi tika.Ko te mahi whakatikatika o te Pfu polymerase ka iti ake nga hapa i te raupapa whakamutunga ka whakaritea ki te Taq DNA polymerase.I roto i nga tau tata nei, kua kitea etahi atu whaakiki whakatikatika, a kua mahia nga whakarereketanga o te enzyme Pfu taketake hei whakaiti ake i te reeti hapa i te wa e whakakaha ana te DNA.

RT-PCR

Ko te PCR whakamuri, he RT-PCR ranei, ka taea te whakamahi i te RNA hei tauira.Ko tetahi atu taahiraa ka taea te kite me te whakanui i te RNA.Ko te RNA ka huri whakamuri ki te DNA taapiri (cDNA), ma te whakamahi i te transcriptase whakamuri.Ko te kounga me te ma o te tauira RNA he mea nui mo te angitu o te RT-PCR.Ko te mahi tuatahi o te RT-PCR ko te whakahiato o te ranu DNA/RNA.Ko te transcriptase whakamuri he mahi RNase H, e whakaheke ana i te waahanga RNA o te ranu.Ka oti te ngota ngota DNA-kotahi e te ngohe DNA polymerase-a-DNA o te whakawhitinga whakamuri ki te cDNA.Ko te kaha o te tauhohenga whenu tuatahi ka pa ki te mahi whakakaha.Mai i konei, ka whakamahia te tikanga PCR paerewa hei whakanui i te cDNA.Ko te kaha ki te whakahoki i te RNA ki roto i te cDNA na te RT-PCR he maha nga painga, a ka whakamahia mo te tātari whakaaturanga ira.Ko te RNA he whenu kotahi, he tino koretake, he uaua ki te mahi.Ko te tikanga he mahi tuatahi i roto i te qPCR, e tohu ana i nga tuhinga RNA i roto i te tauira koiora.

qPCR me RT-qPCR

Ka whakamahia te PCR ine (qPCR) ki te kimi, ki te tohu me te ine i te waikawa karihi mo nga tono maha.I roto i te RT-qPCR, ko nga tuhinga RNA ka tohua ma te huri whakamuri ki te cDNA i te tuatahi, pera i te korero i runga ake nei, katahi ka mahia te qPCR.Pērā i roto i te PCR paerewa, ka whakanuia te DNA e toru nga hikoinga tukurua: te denaturation, annealing, me te elongation.Heoi, i roto i te qPCR, ka taea e te tapanga rewharewha te kohi raraunga i a PCR e ahu whakamua ana.He maha nga painga o tenei tikanga na te maha o nga tikanga me nga matū e waatea ana.

I roto i te qPCR e ahu mai ana i te waikano (te nuinga o te mea kaakaariki), ka taea e te tapanga korakora te ine i te inenga o nga ngota ngota DNA kua whakanuia ma te whakamahi i te waikano here dsDNA.I roto i ia huringa, ka inehia te rewharewha.Ka piki ake te tohu o te rewharewha ki te nui o te DNA tukurua.No reira, ka tohua te DNA i roto i te "wa-waa" (Fig. 3).Ko nga ngoikoretanga o te qPCR-waikano ko te kotahi anake te whaainga ka taea te tirotiro i te wa kotahi ka herea te waikano ki tetahi ds-DNA kei roto i te tauira.

I roto i te qPCR i runga i te rangahau, he maha nga whaainga ka kitea i te wa kotahi i ia tauira, engari me arotau me te hoahoa o te (ng) rangahau motuhake kua whakamahia hei taapiri atu ki nga kaupapa tuatahi.He maha nga momo hoahoa rangahau e waatea ana, engari ko te momo tino rongonui ko te rangahau hydrolysis, e whakauru ana i te fluorophore me te tinei.Ko te whakawhitinga o te hiko o te resonance resonance (FRET) ka aukati i te tukunga o te fluorophore ma te tiihi i te wa e mau tonu ana te tirotiro.Heoi, i te wa o te tauhohenga PCR, ka whakamarohia te rangahau i te wa o te toronga tuatahi me te whakakaha o te raupapa motuhake e herea ana.Ko te mahanga o te rangahau ka wehe i te fluorophore mai i te tiihi ka puta he pikinga-whakaaro-whakanui o te rewharewha (Fig. 4).No reira, ko te tohu rewharewha mai i te tauhohenga qPCR e pa ana ki te rangahau he orite ki te nui o te raupapa whaainga rangahau kei roto i te tauira.Na te mea he mea motuhake ake te qPCR e ahu mai ana i te rangahau i te qPCR-waikano, he maha tonu nga hangarau e whakamahia ana i roto i nga whakamatautau tātaritanga a-qPCR.

Te Whakanui Isothermal

Ko nga tikanga PCR kua whakahuahia i runga ake nei e hiahia ana ki nga taputapu whakamaarama hiko utu nui kia tika te piki me te heke o te mahana o te ruma mo te denaturation, annealing, me te toronga.He maha nga tikanga kua whakawhanakehia e kore e hiahiatia he taputapu tika ka taea te mahi i roto i te kaukau wai ngawari, i roto ranei i nga ruma o te hiahia.Ko enei tikanga e kiia ana ko te whakakaha hauwaro me te mahi i runga i te whakakaha taupū, raina, me te whakahiato.

Ko te momo whakakaha hauwaariki e tino mohiotia ana ko te whakawhaanui-a-roopu-whakawaenga, ko te LAMP ranei.Ka whakamahi te LAMP i te whakakaha taupūtanga i te 65⁰C hei whakanui i te tauira DNA, RNA ranei.I te wa e mahi ana i te LAMP, e wha ki te ono nga tohu tuatahi e hono ana ki nga rohe o te DNA ka whakamahia me te polymerase DNA hei whakahiato i te DNA hou.E rua o enei mea tuatahi he raupapa whakahiato e mohio ana ki nga raupapa i roto i era atu tuatahi ka herea, ka taea te hanga "kopiko" ki te hanga i roto i te DNA katahi ano ka whakahiatohia ka awhina i te whakauru tuatahi i roto i nga rauna whakakaha ake.Ka taea te tiro ki te rama ma te maha o nga tikanga, tae atu ki te fluorescence, te electrophoresis gel agarose, te colorimetry ranei.Ko te ngawari ki te tiro me te kite i te aroaro o te kore ranei o te hua ma te karaehe me te kore o nga taputapu utu nui e hiahiatia ana ka waiho a LAMP hei whiringa pai mo te whakamatautau SARS-CoV-2 i nga waahi kaore i te waatea te whakamatautau taiwhanga haumanu, te rokiroki me te kawe tauira. kaore i taea, i roto ranei i nga taiwhanga karekau he taputapu whakamaarama PCR i mua.