Ko te RT-qPCR te whakamātautau taketake o te koiora rāpoi, ā, me mōhio te katoa.Kei roto i te nuinga o nga waahanga e toru: te tangohanga RNA, te whakamaoritanga whakamuri ki roto i te cDNA, me te PCR ine-a-wa-tuuturu.Kaore i te awhina, he aha kei te haere?Ko te mea pea he raruraru kite whakamatautau whakamuri tuhinga!Ahakoa te ahua ko te whakamatautau whakawhiti whakamuri me taapiri noa i te RNA, te dNTP, te tuatahi, me tewhakamuri transcriptaseki te ngongo centrifuge me te uru pai, engari i roto i te tukanga mahi tūturu, he maha tonu nga korero e tika ana kia arohia.Kia ako tatou mo tena!

Me pehea te whakatau i te kounga o te RNA?
Ki te whiwhi cDNA, he mea nui te kounga o te RNA!Ka kitea te kounga o te RNA mai i nga waahanga e rua:
(1) RNA tapatahi:Ka taea te manatoko i te tika o te RNA ma te electrophoresis gel agarose. Hei tauira, ko te tapeke katoa o te RNA e toru nga roopu maamaa, ko nga taumahatanga ngota mai i te rahi ki te iti ko te 28S, 18S, me te 5S, me te 28S he rua te kanapa o te 18S;mena ka kitea nga roopu e toru, engari ko te momo roopu kei te rangirua, ko te Diffusion ranei, ko te tikanga kua heke te RNA.I tenei wa, mahia te tauhohenga whakawhiti whakamuri i nga wa tonu ka whakanuia te whakauru tauira kia tika;mena he roopu iti noa te taumaha ngota, karekau he roopu ka kitea, kua tino whakahekehia te RNA me te tango ano.Ko te Agilent 2100 e tohu ana i te tika o te RNA me te hoahoa teitei me te uara RIN.Mena kei te mau tonu te waikawa karihi, he papatahi te turanga o te electropherogram;ki te tino whakahekehia te waikawa karihi, karekau he taurite te turanga, ka nui ake nga tihi whakahekenga ka puta;Ko te uara o te RIN e whakaatu ana i te tika o te RNA, i roto i te awhe o te 0-10, ko te nui o te uara, ko te pai ake o te kounga o te RNA.Ana, ko te teitei ake te tohu o te whakaoti.
(2) Maama o te RNA:Ko te ōwehenga o OD260/280 ka kitea e te UV spectrophotometry.Mena ko te tauwehenga o OD260/280 kei waenganui i te 1.9 me te 2.1, he tino pai te ma.
Ko te toenga o te DNA genomic ka arahi ki nga hua ine ine
Ina tangohia te RNA, ka uru pea te RNA ka whiwhi tatou ki te DNA genomic (gDNA) kaore ano kia horoia.Na reira, ko te cDNA i muri i te whakawhitinga whakamuri ka konatunatua kigDNA.I te wa o raroqPCRtauhohenga,cDNAme te gDNA ka taea te whakanui i te wa kotahi, ka hua he iti te uara CT, na reira ka kore e pai nga hua.
Na me aha tatou i tenei ahuatanga?Foregenewhakaaro:
(1) Mahia te horoi ira ira ki te RNA whakamuri, ka taea te tango ma te tangohanga pou i te wa tangohanga RNA;
(2) Tuhia te RNA kua tangohia me te DNaseI , engari whakamutua ki te EDTA;
o nga reagents whakawhitinga whakamurime nga kōwae whakawātea iraira;

Me pehea te kowhiri i nga timatanga mo te tuhi whakamuri?
Ka pa ano hoki nga tuhinga tuatahi o te tuhi whakamuri ki te putanga o te tauhohenga whakawhiti whakamuri.Ka taea e koe te kowhiri i nga timatanga matapōkere, Oligo dT, ira motuhake ranei mo te tuhi whakamuri i runga i nga ahuatanga motuhake o te whakamatautau:
(1) Tuhituhi motuhake: ka tūtohuhia nga kaupapa tuatahi mo te ira;
(2) Ko nga tuhinga mahanga roa: Ko te Oligo dT/te ira-a-ira e taunakihia ana;
(3) Nga wahanga o roto o nga tuhinga waahanga-roa: nga papaa-ira-a-ira/ nga mea matapōkeretanga / nga mea tuatahi + Oligo dT.Mena ka mahia te whakamatautau qPCR e whai ake nei, kaore e taea te whakamahi i a Oligo dT anake, na te mea ko te whakamahi i te Oligo dT anake ka taea te 3′ mutunga rītaha, e arai ai i nga hua whakamatautau qPCR;
(4) miRNA: Ka taea te whakamahi i nga papa-a-kaupapa, i nga hiku ranei.

E hia nga wa me whakangawarihia te cDNA hua tuhi whakamuri mo te ine?
I muri i te whiwhinga o te cDNA o te hua whakawhiti whakamuri, e hia nga wa me waimeha te cDNA mo nga whakamatautau qPCR he mea nui.Mena he tiketike rawa, he iti rawa ranei te kukū o te cDNA, ka raru pea te kaha whakakaha.Ka taea te ine i te kukū cDNA, me pehea te mahi?
(1) Kaore e taea te ine i te kukū o te cDNA o te hua whakawhiti whakamuri, na te mea i tua atu i te hua cDNA, kei roto ano hoki i te hua whakamuri te whakamaoritanga te toenga Buffer, whakamuri transcriptase, primers, me etahi atu, ka whakararu i nga hua ine inenga ka puta te OD260/280, OD260/230.I tenei wa, ka ki mai etahi hoa, katahi ka ine ahau i te kukū i muri i te purenga;i konei, e hiahia ana a Foregene ki te whakamahara kaore i te tūtohutia kia purea te cDNA, no te mea he rereke te roa o te cDNA i riro mai i te hurihanga, a ka ngaro te cDNA poto i te purenga.
(2) Na me aha koe?I mua i te whakamatautau qPCR, ka taea te whakatau i te rōnaki waimeha o te cDNA ma te whakamatautau-mua.Hei tauira: whakamahia te wairewa rakau cDNA, te waimeha 10-pi, me te waimeha 100 hei tauira mo nga whakamatautau qPCR, ka tohua te tauwehe waimeha me te uara CT i te awhe 18-28.

Me pehea te tuhi whakamuri i nga miRNA?
Ko te miRNA he RNA ngota ngota iti kotahi-paetahi me te rahi o te 22 nt e kore e tohu mo te pūmua.Na te poto o te roa, he uaua ki te tatau tika te tikanga qPCR tikanga, no reira he mea tika ki te whakawhānui i te miRNA;Ko nga tikanga whakawhiti whakamuri e whakamahia nuitia ana mo te miRNA ko te tikanga kakau-koropiko me te tikanga hiku.
Ko te tikanga kopikopiko ko te whakaroa i te miRNA ma te taapiri i nga papaa-a-papa.He teitei ake te tairongo me te motuhake o tenei tikanga rapunga, engari he iti te whakaputanga o te kitenga.Ka taea e tetahi tuhinga whakamuri te kite i tetahi miRNA me tetahi tohutoro o roto;Ko te tikanga taapiri hiku he mea tito e rua Ka oti i te mahi tahi o nga enzyme e rua, ko te PolyA polymerase me te reverse transcriptase.Ko te PolyA polymerase te kawenga mo te taapiri i nga hiku PolyA ki te miRNA hei whakanui ake i tona roa, a ko te whakamuri transcriptase e mahi ana i te tauhohenga whakawhiti whakamuri.He nui te whakaputanga o tenei tikanga ka taea te kite i nga miRNA maha me nga tohutoro a-roto i roto i te tuhinga whakamuri kotahi, engari he iti te tairongo me te motuhake i roto i te tikanga kakau-koropiko.