PCR, maha PCR, I roto i te waahi PCR, Whakamuri PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Ka tohatohahia e matou nga ariā, nga hikoinga me nga taipitopito o nga momo PCR

Ⅰ. PCR

Ko te Reaction Chain Polymerase, e kiia ana ko te PCR, he hangarau koiora ngota e whakamahia ana hei whakanui i nga maramara DNA motuhake.Ka taea te kii he tukurua DNA motuhake in vitro.I kitea te DNA polymerase (DNA Polymerase I) i te timatanga o te tau 1955, me te Klenow Fragment o E. Coli, he uara whakamatautau me te whaihua, i kitea e Dr. H. Klenow i te timatanga o te 1970s, engari na te kore o tenei enzyme e aro ki te pāmahana, ka taea e te pāmahana teitei te whakaheke, no reira ka kore e tutuki te tauhohenga polymerasegene teitei.Ko nga enzyme e whakamahia ana i enei ra (e kiia ana ko Taq polymerase), i wehea mai i te Thermus aquaticus, he huakita waiariki i te tau 1976. Ko tona ahuatanga ka taea e ia te atete i te teitei o te pāmahana, he mea pai hoki, engari ka whakamahia nuitia i muri i nga tau 1980.Ko te ariā taketake o te tauira tuatahi o te PCR he rite ki te whakatikatika me te kape ira, i whakaarohia e Takuta KJell Kleppe i te tau 1971. I whakaputaina e ia te kape ira tuatahi ngawari me te wa poto (he rite ki nga tauhohenga huringa tuatahi e rua o te PCR).Ko te PCR i whakawhanakehia i tenei ra i hangaia e Dr. Kary B. Mullis i te tau 1983. I mahi a Dr. Mullis ki nga kamupene PE i taua tau, na reira he mana motuhake to PE ki te umanga PCR.I whakaputa mana e Takuta Mullis te pepa tuatahi e pa ana ki a Saiki me etahi atu i te tau 1985. Mai i tera wa, he mano maero te whakamahi PCR i ia ra, a ko te kounga o nga pepa e pa ana ka taea te kii he maha atu nga tikanga rangahau e kore e pai.I muri mai, ka whakamahia nuitia te hangarau PCR i roto i te rangahau pūtaiao koiora me nga tono haumanu, ka noho hei hangarau tino nui mo te rangahau koiora rapoi.I toa ano a Mullis i te Tohu Nobel mo te Matū i te tau 1993.

PCRTikanga

Ko te maapono taketake o te hangarau PCR he rite ki te tukanga tukuruatanga maori o te DNA, a ko tona motuhake ka whakawhirinaki ki te oligonucleotide primera e hono ana ki nga pito e rua o te raupapa whainga.Ko te PCR e toru nga waahanga tauhohenga taketake: ①Degeneration o te tauira DNA: I muri i te whakamahana o te DNA tauira ki te 93°C mo tetahi wa roa, ko te otinga DNA rua mo te DNA mekameka-rua i hangaia e te PCR whakakaha o te tauira DNA Ka wehe, ka waiho hei mekameka kotahi kia taea ai te whakakotahi mo te tauhohenga o muri mai.②Ko te whakawhanaunga (compound) o te tauira DNA me te tuatahi: I muri i te whakamahana o te tauira DNA ka paheke ki te mekameka kotahi, ka heke te mahana ki te 55°C.Ko te raupapa taapiri o te tuatahi me te tauira DNA mekameka kotahi.③Ko te toronga o te tuatahi: tauira DNA-ko te herenga tuatahi i ahu mai i te mahi a TaqDNA polymerase, me te dNTP te rauemi mata tauhohenga.Kia mau ki te kaupapa o te tukurua, whakahiatohia he mekameka kape hou kua rahuitia hei whakakii i te mekameka DNA tauira, me te tukurua i te huringa whakahekenga-annealing-toronga e toru nga tukanga ka nui ake te "meini kape kua rahuitia", ka waatea ano tenei mekameka hou Hei tauira mo te huringa ka whai ake.E 2-4min te roa ki te whakaoti i te kopae, ka taea te whakanui ake i te ira whainga e hia miriona nga wa i roto i te 2-3 haora.

PaerewaPCRPūnaha Tauhohenga

E rima nga waahanga o te tauhohenga PCR

E rima nga momo matū kei roto i te tauhohenga PCR, ara te tuatahi, te enzyme, te dNTP, te tauira me te buffer (Mg2+ e hiahiatia ana).[Tuhinga PCR]

Ko te tukanga PCR paerewa kua wehea kia toru nga waahanga

1. Te whakahekenga o te DNA (90°C-96°C): Ko nga tauira DNA mekameka-rua i raro i te mahi wera, ka pakaru nga here hauwai, ka hanga he DNA mekameka kotahi.

2. Te Aina (25 ℃ -65 ℃): Ka whakahekehia te pāmahana o te punaha, ka honoa te tuatahi ki te tauira DNA hei hanga i tetahi mekameka-rua o te rohe.

3. Toronga (70 ℃ -75 ℃): I raro i te mahi a Taq enzyme (mo te 72°C, te mahi pai rawa atu), ka whakamahia te dNTP hei rauemi mata, ka toro atu i te 5′ te pito o te tuatahi → 3′ te mutunga, te whakahiato me te tauira hei whakakii tetahi ki tetahi mekameka DNA.

Ko ia huringa ka whakahekehia, ka herea, ka whakaroahia, ka ruarua te ihirangi DNA.I tenei wa, na te poto o te waahi whakanui, ka taea te tukurua etahi PCR i roto i te wa poto noa ahakoa kaore i te tino pai te mahi a te Taq enzyme, na reira ka taea te huri ki nga waahanga e rua, ara, ka taea te mahi i te annealing me te toronga i te 60°C-65°C i te wa ano.Hei whakaiti i te tukanga o te hiki me te whakamatao me te whakapai ake i te tere whakautu.

Ko nga ahuatanga PCR Reaction

● Teitei-Teitei

Ko nga mea tino whakatau o te urupare PCR ko: ①Ko te huinga motuhake o te tuatahi me te tauira DNA.②Ko te kaupapa o te takirua turanga.③Ko te pono o te tauhohenga whakahiato polymerase TaqDNA.④Ko te motuhake me te atawhai o te ira whainga.

Ko te whakakotahitanga tika o nga timatanga me nga tauira te mea nui.Ko te herenga o te papa tuatahi me te tauira me te toronga o te mekameka tuatahi e ahu mai ana i runga i te kaupapa o te taurite turanga kawakore.Ko te pono o nga tauhohenga whakahiato polymerase me te parenga teitei o te pāmahana o te Taq DNA polymerase ki te hanga i te herenga (huihui) o te tauira me te tuatahi i roto i te tauhohenga ka taea te mahi i te pāmahana teitei ake.Ko te motuhake o te huinga ka tino piki ake.Ka taea e te topenga te pupuri i te tino tika.Ma te kowhiri i tetahi rohe ira whainga me te tino tiaki me te tino tiaki, ka teitei ake tona motuhake.

● Te Manawao Nui

Ko te rahinga whakaputa o nga hua PCR ka piki ake ma te taurangi, ka taea te whakawhanui i te tauira timatanga o Picker (PG=10-12) ki te whakapiki ake i te taumata o te microcontroller ki te taumata o nga micrograms (μg= -6).Ka kitea he pūtau whainga mai i te 1 miriona pūtau;i roto i te kitenga o nga huaketo, ka taea e te tairongo o te PCR te tae ki te 3 RFUs (nga waahi kore i hangaia nga waahanga);ko te iti rawa o te kite i roto i te pūtaiao huakita he 3 huakita.

● He ngawari me te tere

Ka whakamahia e te whakaata a PCR te Taq DNA polymerase teitei-te pāmahana, e taapiri ana i te otinga tauhohenga i te wa kotahi, ara, he tauhohenga whakaheke-anneal-toronga i runga i te otinga whakakaha DNA me te kohua pati wai.Ko te tikanga, ka oti te tauhohenga whakakaha i roto i te 2 ki te 4 haora.Ko nga hua kua whakanuia ka tātarihia e te hoari hiko, kaore e whai waahi ki te whakamahi i nga waahi, kaore he parahanga radioactive, me te ngawari ki te whakatairanga.

● He iti te ma o te tauira

Kaore he take ki te wehe i nga huaketo, huakita me nga pūtau ahurea.Ka taea te whakamahi i nga hua parakore DNA me te RNA hei whakakaha.Ka taea te whakamahi tika te rapunga whakakaha DNA ma te whakamahi i nga tauira haumanu penei i te toto, te wai tinana, te wai horoi mare, te makawe, nga pūtau, me te kiko ora.

PCRraruraru noa

● He kino kino, kaore he roopu whakakaha

Ko nga waahanga matua o te tauhohenga PCR ko: ① te whakarite i nga waikawa nucleic tauira, ② te kounga me te motuhake o nga mea tuatahi, ③ te kounga o nga enzymes ④ nga ahuatanga o te huringa PCR.Ko te kimi i te take me wetewetehia me te ako mo nga hononga o runga ake nei.

Tātauira: ① Kei te tauira he momo pūmua, ② Kei roto i te tauira ko te Taq enzyme inhibitor, ③ Ko te pūmua kei roto i te tauira kaore e whakakorehia, ina koa ko te roopu roopu kei roto i te chromosome.⑤ Ko te whakahekenga o te waikawa karihi Deminer kaore i tino rite.Ina he pai te kounga o nga enzymes me nga mea tuatahi, karekau he roopu whakakaha, ko te tikanga ko te maimoatanga nakunaku o nga tauira.He mea he ki te tauira tangohanga waikawa karihi tauira, no reira ki te whakarite i tetahi otinga nakunaku pai me te pumau, me whakatika tona tikanga, kaua e whakarereketia.

Te whakahohenga o te enzyme: me whakamahi tahi he enzyme hou me nga whaariki tawhito me nga mea hou ki te tātari mena kua ngaro, kua kore ranei te mahi o te enzyme, ka puta he kino kino.Me tohu ko Taq enzyme, ethidium bromide ranei i etahi wa ka warewarehia.

Primer: te kounga o te tuatahi, te kukū o te tuatahi, me te mea he hangarite te kukū o nga mea e rua.He take noa mo te rahunga PCR, kaore ranei te roopu e piki haere ana i te pai me te kaha ki te marara.He raruraru kei te kounga o nga pukapuka tuatahi o etahi tau puranga.He teitei te kukū me te iti o te kukū o nga papa tuatahi e rua, na te iti -efficiency whakakaha hangarite.Ko nga mahi aukati: ① Tīpakohia he tuatahi pai hei whakahiato wae.② Ko te kukū o te tuatahi ehara i te mea ko te uara OD anake, engari ka aro ano ki te wai taketake o te tuatahi ki te hanga i te electrophoresis kara huka.Me noho he rohe weriweri tuatahi, me te kanapa o nga papa tuatahi e rua kia rite tonu.Belt, PCR ka ngaro pea i tenei wa, a me whakatau ma te waahanga tuatahi.Mena he tiketike te tuatahi, he iti te kanapa, a me taurite tona kukū ina waimeha.③ Me utu te tuatahi me te penapena ki te kukū teitei kia kore ai e maha nga wahanga tio me nga wahanga whakamatao mo te wa roa o te pouaka whakamatao, ka kino, ka heke te tuatahi.④ Ko te hoahoa o te papa tuatahi he koretake, penei i te iti o te roa o te papa tuatahi, ka hangahia te di cluster i waenganui i nga papa tuatahi.

Mg2+concentration: Mg2+ion concentration he nui te paanga ki te pai o te whakakaha PCR.Ka taea e te kukū nui te whakaiti i te ira tangata o te whakakaha PCR.Mēnā he iti rawa te kukū, ko te putanga whakakaha PCR ka kore te whakakaha PCR me te kore te roopu roha.

Te huringa o te rōrahi tauhohenga: Ko te rōrahi e whakamahia ana i roto i te PCR amplification ko 20ul, 30ul, me te 50ul or 100uL, ko te nui o te tono mo te PCR amplification kua whakaritea kia rite ki nga kaupapa rereke o te rangahau pūtaiao me te whakamatautau haumanu.I muri i te hanga i nga pukapuka iti penei i te 20ul, he mea tika ki te hanga i te ahua o te taura i te wa e hanga ana te rahi, ki te kore ka kore.

Nga take a-tinana: He mea nui te huringa mo te whakakaha PCR.Mena he iti te paanga o te paheketanga, he poto te wa whakaheke, ka puta pea i roto i nga kino kino;Ko te iti rawa o te pāmahana whakahiato ka taea te whakakaha kore-motuhake me te whakaiti i te kaha whakakaha motuhake.Ka tino pa ki te whakakotahitanga o nga mea tuatahi me nga tauira hei whakaiti i te kaha o te whakakaha PCR.I etahi wa e tika ana ki te whakamahi i nga inemahana paerewa kia kitea te rerekeetanga, te whakamaaramatanga me te roanga o te pāmahana i roto i te toronga, te tunu kai wairewa ranei, koinei tetahi o nga take mo te kore o te PCR.

Nga rereke o te raupapa whainga: Mena ka puta te raupapa whaainga, he rerekee, he whakakore ranei, ka whakakotahihia te whakakotahitanga o te tauira me te tauira, na te kore o te raupapa whainga, ka ngaro te raupapa taapiri i te tuatahi me te tauira, a ka kore e angitu tana whakakaha PCR.

● He pai te korero teka

Ko te roopu whakakaha PCR ka rite ki te roopu raupapa whainga, a, i etahi wa ka pai ake, ka teitei ake te roopu.

Kaore e tika ana te hoahoa tuatahi: he homologous te raupapa whakakaha kua tohua me te raupapa whakakaha kore-purpose, no reira ka whakakaha PCR, he raupapa kore-purposeful nga hua PCR whakakaha.He poto rawa te raupapa whainga, he poto rawa ranei te pukapuka tuatahi, a he pai ki te he.Me hoahoa ano.

Te parahanga whiti o te raupapa whainga, hua whakakaha ranei: E rua nga take mo tenei parahanga: Tuatahi, te parahanga whakawhiti o te ira katoa, nga waahanga nui ranei, ka puta ki nga hua pai.Ka taea te whakatau i tenei momo pai teka ma nga tikanga e whai ake nei: Kia tupato me te ngawari i te wa e mahi ana kia kore ai e ngotea te raupapatanga ki roto i te pu tauira ka pakaru mai ranei i te ngongo centrifugal.Hāunga ngā whākōkī me ngā matū e kore e taea te tu atu ki te pāmahana teitei, me whakakorehia nga reagents me nga taputapu katoa ki te pehanga teitei.Me whakamahi nga putorino centrifugal me nga tauira i te wa kotahi.I te wa e tika ana, i mua i te taapiri i nga tauira, ka kitea te ngongo tauhohenga me te reagent ki nga hihi ultraviolet hei whakangaro i te waikawa karihi.Tuarua, ko nga kongakonga iti i roto i te parahanga hau.He poto ake enei kongakonga iti i te raupapa whainga, engari he homology etahi.Ka taea te hono tetahi ki tetahi.I muri i te whakakii i nga mea tuatahi, ka taea te whakawhanui i te hua PCR, ka puta he hua pai teka.Ka taea te whakamahi hei whakaiti, hei whakakore ranei i te tikanga PCR ohanga.

● Ka puta te roopu whakakaha kore motuhake

Ko nga roopu i puta mai i muri i te whakakaha PCR kaore i te rite ki te rahi e tumanakohia ana, he nui, he iti ranei, i te wa ano, i te wa ano ranei, nga roopu whakakaha motuhake me nga roopu whakakaha kore-motuhake.Ko te putanga mai o nga roopu kore-motuhake ko: Tuatahi, karekau i oti te whakaurunga o nga mea tuatahi ki te raupapa whainga, ko te polymerization ranei o te tuatahi ki te hanga i te kahui di.Ko te tuarua he tiketike rawa te kukū o nga katote MG2+, he iti rawa te pāmahana whakahiato, he hononga hoki te maha o nga huringa PCR.Tuarua, ko te kounga me te nui o nga enzymes.I te nuinga o nga wa, ko nga enzymes o etahi puna ka ngawari ki nga roopu kore-motuhake, a kaore i puta nga enzyme o tetahi atu puna.I etahi wa ka puta ano te whakakaha kore-motuhake o nga whākōkī.Ko nga mahi aukati ko: i hoahoa ano i nga mea ataahua mena e tika ana.Whakaititia te nui o te whākōkī, whakakapi rānei i te whākōkī o tētahi atu mātāpuna.Whakaitihia te nui o te tuatahi, whakanuia te nui o nga tauira tika, me te whakaiti i te maha o nga huringa.Kia tika te whakanui ake i te pāmahana whakaenee, whakamahia ranei te tikanga ira pāmahana e rua (93°C te whakahekenga, te whakaene me te toro atu ki te 65°C).

● Puta mai he toka, he rīpene pania ranei

Ko te whakakaha PCR i etahi wa ka whakamahia, he maa, he whariki ranei te whitiki.Mo te take, na te nui rawa o nga enzymes, te kino ranei o te kounga o te enzyme, he tiketike rawa te kukū o te dNTP, he tiketike rawa te kukū Mg2+, he iti rawa te pāmahana o te annealing, he nui rawa te maha o nga huringa.Ko nga mahi aukati ko: ①Whakaitihia te nui o nga enzymes, whakarereke ranei i te whaakiki o tetahi atu puna.②Whakaitihia te kukū o te dNTP ③Whakaitihia te kukū Mg2+.④Whakanuia te maha o nga tauira me te whakaiti i te maha o nga huringa.

Hua e Pa ana

PCR Heroᵀᴹ (Me te Waikano)

◮ Te pono teitei ake: 6 nga wa i to te Taq enzyme noa;

◮ He tere ake te whakakaha

◮ He nui ake te urutau tauira

◮ He pai ake te whakakaha ake

◮ He kaha ake te manawanui o te taiao: ka tuu ki te 37°C mo te wiki, neke atu i te 90% te mahi;

◮ He 5'→3' te ngohe DNA polymerase me te 5'→3' mahi exonuclease, kaore he mahi exonuclease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (Me te Waikano)

Ko te punaha tauhohenga ahurei me te kaha nui o te Taq DNA Polymerase ka nui ake te pai o te whakakaha, te motuhake me te tairongo o te tauhohenga PCR.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Kotahi Hipanga)-SYBR Green I

◮ Ko te kete kotahi-taahiraa ka huri whakamuri me te qPCR e rua nga tauhohenga i roto i te ngongo kotahi, me taapiri noa te RNA tauira, nga tohu tuatahi PCR me te RNase-Free ddH₂O.

◮ Ka taea e te kete te wetewete tere me te whai hua te ine ine RNA viral, te tohu RNA ranei.

◮ Ka whakamahia e te kete he reagent whakawhiti whakamuri motuhake a Foregene me te Foregene HotStar Taq DNA Polymerase i honoa ki tetahi punaha tauhohenga ahurei kia pai ake ai te kaha whakakaha me te motuhake o te tauhohenga.

◮ Ko te punaha tauhohenga kua arotauhia ka nui ake te maaramatanga o te tauhohenga, te kaha ake o te waiariki, me te pai ake o te manawanui.

◮ RT-qPCR Hewari^TM(Kotahi Hipanga)-Ka tae mai te kete SYBR Green I me te tae tohutoro o roto o te ROX, ka taea te whakamahi ki te whakakore i te papamuri tohu me nga hapa tohu i waenga i nga puna, he pai ki nga kaihoko ki te whakamahi i nga tauira rereke o nga taputapu PCR ine.

RT ngawari^TMII (Master Premix mo te whenu tuatahi cDNA synthesis moPCR Wā Tūturu)

-He kaha ki te tango i te gDNA, ka taea te tango i te gDNA i roto i te tauira i roto i te 2 meneti.

- He pai te punaha whakawhiti whakamuri, he 15 meneti noa iho hei whakaoti i te whakahiatotanga o te whenu tuatahi cDNA.

-Tairaira Matatini: ka taea hoki te huri i nga tauira me te GC teitei me te hanganga tuarua matatini me te tino pai.

-Ko te punaha whakamuri whakamuri teitei, ka taea e nga tauira taumata-pg te tiki cDNA kounga teitei.

-Ko te punaha whakamuri whakamuri he nui te waiariki, ko te pāmahana tauhohenga tino pai ko te 42 ℃, a he pai tonu te mahi whakamuri i te 50 ℃.