Kei te korero nga tangata katoa mo te maataapono o te whakamatautau qRT-PCR, te hoahoa tuatahi, te whakamaoritanga hua, me era atu, engari ki taku whakaaro me whakapuaki ahau ki a koe te mahi whakamatautau o te qRT-PCR.He iti, engari mo nga hua.
I mua i te mahi qRT-PCR, me tino mohio tatou ki o tatou ake RNA me nga tikanga mahi.Ka mutu, ko ta tatou mahi he whai hua, kaua ki te parakatihi noa.Na i mua i te mahi qRT-PCR, me whakatau e maatau nga take e whai ake nei (ko etahi e pa ana ki te SYBR anake).
1 Kei te tino mohio koe kaore to RNA i whakaheke?
Ka taea e NanoDrop 2000 anake te kite i te kukū me te ma o te RNA, engari kaore e taea te kite i te tika o te RNA.
Ka taea e te uara RNA (RNA Intesity Number) te whakaatu i te pono o te RNA, ka kitea e te punaha Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Hoahoa hoahoa o nga uara RIN mo nga tauira RNA rereke (eukaryotes)
Heoi, karekau he Agilent 2100 Bioanalyzer a nga taiwhanga.I roto i tenei take, ka taea e tatou te kite na roto i te formaldehyde gel, engari ko te hiahia mo te tapeke o te RNA he tiketike, na ko te tikanga tere ko te whakamahi i nga electrophoresis gel noa.Me noho ki roto i te taiao karihi-kore, no reira me horoi te tank electrophoresis, te pounamu sol, te awhi gel me te heru ki te wai DEPC.Ko te agarose hoki he nuclease-free (i te mea ka whakatuwheratia hou), a me whakatuwhera hou te Loading Buffer kia taea, me te 1.2% gel.
Kia maumahara me tino rewa te ra, ki te kore ka puta he roopu koretake, penei i te tauira 9 i te ahua.Mena he tiketike rawa te ngaohiko, he roa rawa ranei te rere ka puta te wera me te paheketanga o te RNA, no reira me tika te whakahaere i te ngaohiko me te wa.I tua atu, ka taea ano e te rere o te ra te whakatau mena he toenga DNA kei roto i te tauira, me te titiro mena he maha nga roopu pupuri i roto i te puna tuku.
Pikitia.Ko te kitenga ira electrophoresis o te RNA
2 Kei te tino mohio koe mo te kukū o to cDNA?
Ko te wheako o nga tuakana nui i roto i te taiwhanga ko te cDNA o te punaha 20 ul e whiwhi ana i ia hurihanga he 20X tika, ko nga tuahine i muri i te taote ka diluted 10X.Ko te tikanga ka whakawhirinaki ahau ki te ahuatanga.No te mea he rereke te kounga o te RNA e whakahuahia ana e ia tangata, he rereke ano te taumata o te hurihanga, a, kaore pea i te pumau te hangarau hurihuri.
Na ia wa ka whiwhi ahau i te cDNA whakamuri, ka waimeha tuatahi ahau mo te 3 nga wa, katahi ka whakamahi i te ira tiaki whare ki te mahi RT-PCR, ko te maha o nga huringa ko te tikanga 25 huringa, ki te tautuhi i te kukū motuhake, ka whakatau i te tauwehe waimehatanga whakamutunga.
3 Kei te tino mohio koe he ngawari te whakamahi i o pukapuka tuatahi?
Ka taea te paahi i te pihi rewa o te qRT-PCR, engari he utu tonu tenei.Mo nga taiwhanga kaore he nui o te moni, ina whiwhi ratou i te maha o nga tohu tuatahi, ka taea e ratou te whakamahi i te RT-PCR noa ki te kite mena he roopu kotahi me te tautuhi i te motuhake o nga mea tuatahi.Mena karekau he moni a te taiwhanga, ka taea te tautuhi i te motuhake o nga mea tuatahi katoa ma te pihi rewa.
4 Kei te tino mohio koe kei te pai o tikanga whakamatautau?
Me parea te SYBR mai i te marama kaha, no reira ka ngana ki te whakaweto i te rama o runga ina taapirihia te reagent SYBR, me whakamahi noa i te rama atarua hei whakaoti.
Whakaorangia te SYBR ki te 4°C.I te wa e whakamahia ana, me ata huri ki runga, ki raro kia pai ai te uru kia kore ai e pupuhi te huka, kaua hoki e porangi kaha.
Ko etahi o nga teina he pai ki te tuhi tohu ki runga i te papa PCR mo te mataku kei rahuitia nga tauira, he he.I te mea ka kaha pea o tohu ki te kohi tohu korikori, ka tūtohu ahau ki nga teina ki te whakamahi i nga pukamahi whakamatautau hei awhina i te mahara, penei i raro nei.
Pikitia.qRT-PCR tauira uta hoahoa
5 Kei te tino mohio koe kei te tika koe?
Kia mau ki nga karapu, ki te mau karapu, ki nga karapu, me te korero i nga mea nui e toru nga wa.
Hei whakaiti i te whakakitenga o te SYBR ki te marama, he pai ki ahau te taapiri i tetahi tauira i te tuatahi, penei i te ahua i raro nei.E ai ki nga wheako, ko te taapiri i te iti o te tauira ka puta he hapa tauira.No reira, hei whakaiti i te hapa i puta mai i te taapiri i te iti o te tauira, ko te tikanga ka whakaruaruatia ano e ahau te tauira, ka whakaruarua i te nui ina taapirihia te tauira hei whakaiti i te nui o te H2O2 kua tapiritia.
Pikitia.Hoahoa hoahoa o te uta qRT-PCR
Na ka whirihora i te punaha qRT-PCR e whai ake nei.
Pikitia.Ko te hoahoa whakarite punaha qRT-PCR
FAKATOKANGA: Me mahi te tukanga whirihoranga ki runga tio.
I muri i te taapiri i te tauira, whakapiri i te kiriata hiri maramara.Whakamātauria kia kaua e pa ki te mata o te kiriata hiri marama me o ringaringa, me mahi noa mai i te waahi i nga taha e rua o te kiriata.Na te mea ka pa mai pea nga tapumati ki te kohinga o nga tohu rewharewha.Na ka whakamahi i te centrifuge kia tere te centrifuge mo te 10 hēkona i te tere iti kia kore ai te tauira e iri ki te pakitara.
Hua e Pa ana:
Te wa tuku: Apr-28-2023
