Pūtau Tika RT qPCR Kete—Taqman Direct Cell Lysis Cell Pūtau Reri Kotahi-taahiraa qRT-PCR Kits Probe
Whakaahuatanga
Ka whakamahia e tenei hua he punaha lysis buffer ahurei hei tuku tere i te RNA mai i nga tauira pūtau ahurea mo nga tauhohenga RT-qPCR, me te whakakore i te wa me te mahi purenga RNA mahi, me te 7 meneti noa ki te tiki i te tauira RNA e hiahiatia ana, me te 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman e whakaratohia ana e te kete ka taea te tere me te whai hua i nga hua PCR mo te wa tika.
5× Direct RT Mix me te 2× Direct qPCR Mix-Taqman he kaha te aukati i te aukati, a ka taea e ia te huri pai me te whakakaha ake ma te whakamahi i te lysate o te tauira hei ine hei tauira.Kei roto i te reagent te Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, Reaction Buffer, PCR Optimizer me te Stabilizer, ka taea te whakamahi me te lysis buffer kia tere me te ngawari ki te kite i nga tauira, me nga ahuatanga o te hikaka teitei, te motuhake me te pumau.
Whakatakotoranga
200×20μl Rxns, 1000×20μl rxn
Nga waahanga kete
| TereEasyTMPūtau Tika RT-qPCR Kit-Taqman | ||||
| Nga waahanga kete 20μl qPCR Reaction System | DRT-01021 | DRT-01022 | Tuhipoka | |
| 200 T | 1000 T | |||
|
Wahi I | Kaipupuri CL | 4 ml | 20 ml | Raihana pūtau |
| Foregene Protease Plus II | 80 μl | 400 μl | ||
| Kaipupuri ST | 400 μl | 1 ml × 2 | ||
|
Wahi II | Pūkōmuru DNA | 80 μl | 400 μl | |
| 5×Hanga RT Mix * | 160 μl | 800 μl | RT | |
| 2× Tikanga qPCR Mix-Taqman * | 1 ml × 2 | 1.7 ml × 6 | qPCR | |
| 20×ROX Waikano Tohutoro | 40 μl | 200 μl | ||
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml | 10 ml | ||
| Pukapuka Tohutohu | 1 wahi | 1 wahi | ||
*:Pūtau Lysis, 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ka taea te hoko motuhake
Nga waahanga me nga painga
■He ngawari me te whai hua : me te hangarau Cell Direct RT, ka taea te tiki tauira RNA i roto i te 7 meneti noa.
■ He iti te tono tauira, tae noa ki te 10 nga pūtau ka taea te whakamatautau.
■ Te whakaputanga teitei: ka taea te kite tere i te RNA i roto i nga pūtau i whakatipuria i roto i nga papa 384, 96, 24, 12, 6-puna.
■ Ka taea e te Kaimuku DNA te tango tere i nga momo ira i tukuna, ka tino whakaiti i te paanga ki nga hua whakamatautau ka whai ake.
■ Ko te punaha RT me te qPCR kua arotauhia ka pai ake te whakamaaramatanga whakamuri o te RT-PCR e rua, me te PCR motuhake ake, ka kaha ake te atete ki nga aukati tauhohenga RT-qPCR.
Te tono kete
Te whānuitanga o te tono: nga pūtau ahurea.
- RNA i tukuna e te tauira lysis: e tika ana ki te tauira RT-qPCR o tenei kete.
- Ka taea te whakamahi i te kete mo nga kaupapa e whai ake nei: te tātari whakaaturanga ira, te manatoko o te awenga wahangu o te ira i waenga i te siRNA, te tirotiro tarukino, aha atu.
Rokiroki me te ora o te Papa
Ko te wahanga I o tenei kete me pupuri ki te 4℃;Ko te waahanga II me penapena ki te -20 ℃.
Ko te Foregene Protease Plus II me penapena ki te 4℃, kaua e whakatio ki te -20 ℃.
Reagent 2×Ko Direct qPCR Mix-Taqman me penapena ki -20℃i roto i te pouri;ki te whakamahia auau, ka taea hoki te penapena ki te 4℃ mo te rokiroki mo te wa poto (whakamahia i roto i nga ra 10).
Tikanga Tuturu PCR maataapono hoahoa tuatahi
Primer Whakamua me te Primer Whakamuri
Mo PCR Wā Tuturu, he mea nui te hoahoa tuatahi.Ko nga kaupapa tuatahi e pa ana ki te motuhake me te kaha o te whakanui PCR, a ka taea te hoahoa ma te tohu ki nga kaupapa e whai ake nei:
- Te roa o te tuatahi: 18-30bp.
- Te ihirangi GC: 40-60%.
- Uara Tm: Ka taea e te rorohiko hoahoa tuatahi, penei i te Primer 5, te uara Tm o te tuatahi.Ko nga uara Tm o nga timatanga o runga me te taha whakararo kia tata tonu.Ka taea hoki te whakamahi i te tauira tatauranga Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).I te wa e mahi ana i te PCR, ka tohua te pāmahana i raro iho i te uara Tm tuatahi o te 5 °C hei pāmahana whakaenee (ka taea e te pikinga o te pāmahana whakaenee te whakanui ake i te motuhake o te tauhohenga PCR).
- Nga mea tuatahi me nga hua PCR:
- Ko te roa o te hua whakakaha PCR tuatahi he pai ki te 100-150bp.
- Me karohia nga tauira hoahoa i te waahanga hanganga tuarua o te tauira ka taea.
- Me karo i te hanga 2 neke atu ranei nga turanga taapiri i waenga i nga pito 3′ o nga puna tuatahi o te awa ki raro.
- Kare e taea e te turanga tauranga tuatahi 3′ te noho me te 3 taapiri G, C ranei.
- Ko nga mea tuatahi kaore he hanganga taapiri, ki te kore ka hangaia he hanganga makawe, ka pa ki te whakanui PCR.
- Me tohatoha te ATCG kia rite ki te raupapa tuatahi, me karohia te turanga 3′ hei T.
Apitihanga1:Cell TikaRT-qPCR Waehanga ketet mōkihi tāpiri
1.Cell Lysis Solution
| Rongoa Raihana Pūtau | |||
| Nga waahanga kete (24-puna puna lysis / puna) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| WahiI | Kaipupuri CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Kaipupuri ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| WahiII | Pūkōmuru DNA | 400 μl | 1 ml × 2 |
| RT Mix | |
| Nga waahanga kete (20 μl pūnaha tauhohenga) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Direct RT Mix | 800 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml × 2 |
| qPCR Mix | ||
| Nga waahanga kete (20 μl pūnaha tauhohenga) | DRT-01021-C1 | DRT-01021-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Direct qPCR Mix-Taqman | 1 ml × 2 | 1.7 ml × 6 |
| 20× ROX Waikano Tohutoro | 40 μl | 200 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml | 10 ml |
Pukapuka Tohutohu:
