Ko te whakamatautau RT-qPCR ko te tangohanga RNA me te aromatawai kounga, te whakamaoritanga whakamuri me te qPCR e toru nga waahanga, he maha nga whakatupato i ia taahiraa, ka whakaatuhia e matou nga korero i raro nei.

Ⅰ.Te aromatawai kounga RNA

I roto i te whakamatautau RT-qPCR, i muri i te otinga o te tangohanga RNA, me aromatawaihia te kounga o te RNA, me te whakamatautau whai muri ka taea anake te mahi i muri i tana tohu.Ko nga tikanga arotake ko te spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 tātaritanga, kei roto ko te spectrophotometer me te agarose gel electrophoresis te kimi tikanga.Me tohu ko enei tikanga e rua me whakamahi tahi hei whakaoti i te kitenga me te tātaritanga o te kukū o te RNA, te ma me te pono, kia pai ai te kounga o te RNA.

Kete Motuhake RNA e pa ana: 

Pūtau Tapeke RNA Wehewehenga Kete

Ka taea te whiwhi RNA tapeke tino purea me te kounga teitei mai i nga momo momo tipu i roto i te 11min.

Kararehe Tapeke RNA Isolation Kit

He tere me te whai hua te tango i te RNA tapeke tino parakore me te kounga teitei mai i nga momo kopa kararehe.

Spectrophotometer:

Kei te whakamahia te spectrophotometer ki te whakatau i te kukū me te ma o te RNA, engari kaore e taea te kite i te tika o te RNA me te toenga ira.I roto ia ratou, ko te A260/280 me te A260/230 he tawhā nui mo te rapunga maa o te RNA, a ka kitea te maatanga RNA i runga i te rereketanga o o raatau uara:

1. 1.9< A260/280< 2.1, e tohu ana he pai te purenga RNA;A260/280<1.9, e tohu ana tera pea he toenga pūmua kei roto i te RNA;A260/280>2.1, e tohu ana ka taea te paheketanga wahanga o te RNA, ka taea ano te whakapumau ma te electrophoresis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, e tohu ana he pai te purenga RNA;A260/230< 2.0, e tohu ana tera pea he toenga o nga reagents waro i roto i te RNA, penei i te phenols, te waihano, te huka ranei.

Ko te electrophoresis aarose:

Ka taea e Agarose gel electrophoresis te tātari te pono o te RNA, te ira me te toenga pūmua, engari kaore e taea te tatau tika i te kukū o te RNA, ka kitea ranei nga toenga o nga reagents waro.Tangohia nga tauira RNA eukaryotic hei tauira:

1. I tukuna te RNA ki te electrophoresis gel agarose.Mena e toru noa nga roopu kotahi o te 28sRNA, 18sRNA me te 5.8sRNA kei runga i te mapi ra, e tohu ana kei te mau tonu te RNA kua tangohia.Mena he ahua toia, he tohu te paheketanga o te RNA.

2. Mena he roopu kanapa kotahi kei waenganui i te kohao kapia me te roopu 28sRNA, tera pea he toenga DNA ira.

3. Ki te puta nga here ki roto i te kohao kapia, ka tohu tera pea he toenga o te pūmua me etahi atu matū macromolecular.

Ⅱ. Whakamuri whakamuri

Ka oti te tangohanga RNA, me huri ki te cDNA mo nga whakamatautau ka whai ake, no reira he mea nui te mahi whakamuri.Ko te tuhi whakamuri ka whakauruhia mai i te kowhiringa o te whakamuri transcriptase me te tuatahi:

Te whiriwhiringa transcriptase whakamuri:

Ko nga tuhinga whakamuri angamaheni ko AMV RTase me MMLV RTase.Ko te RNase H o AMV RTase he mahi kaha, he poto te roa o te whakahiato, he iti te nui o te whakahiato me te pai o te waiariki (42 ~ 55 ℃).Ko te mahi RNase H o MMLV RTase he ngoikore, he roa te roa o te whakahiatotanga, he nui te nui o te whakahiato, he ngoikore te pumau o te waiariki (37 ~ 42 ℃).

Na te mea ko te RNase H enzyme he mahi whakaheke i te tauira RNA, ko te MMLV me te ngoikore o te ngohe RNase H me pai ake te kowhiri i te wa o te whakawhiti whakamuri, a, i muri mai i te hangahanga ira, kua eke te waiariki o MMLV ki te mokoke kounga.Te tango ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV mo te tuhi whakamuri) hei tauira, he transcriptase whakamuri hou e whakaatuhia ana i roto i nga huakita i hangaia e E. coli ma te whakamahi i te hangarau whakakotahitanga ira.He DNA polymerase whakakotahi e whakahiato ana i te whenu DNA taapiri mai i te RNA, te DNA, te RNA:DNA ranu ranei.Karekau he mahi RNase H, he kaha te pumau, te hononga RNA kaha, me te aro nui ki te kitenga.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV mo te tuhi whakamuri)

Te kowhiringa tuatahi:

Ko te tikanga ka taka nga kaupapa tuatahi RT ki nga waahanga e toru: oligo dT, matapōkeretia, me nga ira-motuhake.Tīpakohia ngā pūmua e tika ana hei whakamahi i runga i ngā whakaritenga whakamātautau rerekē.

1. Mēnā nō te eukaryotic te tātauira, ā, ka whakamahia te cDNA tōmuri mō te whakakaha PCR, ka tūtohutia a Oligo (dT);Mena ka whakamahia noa te whakamatautau ka whai ake mo te qPCR, ka tūtohuhia a Oligo (dT) kia konatunatua ki nga matapae matapōkere hei whakapai ake i te pai o te tuhi whakamuri.

2. Mēnā nō ngā prokaryotes te tātauira, me kōwhiria te Random Primers me ngā pūmua ira motuhake mō te whakawhiti whakamuri.

Ⅲ.qPCR

Ko te inenga o te Fluorescence i te nuinga o te waa mai i te kowhiringa o nga tikanga ine, nga maataapono hoahoa tuatahi, te kowhiringa ROX, te whirihoranga o te punaha tauhohenga me te whakatakoto tikanga tauhohenga, aha atu.

Te kowhiringa tikanga ine:

Ka wehewehea nga tikanga ine ki nga tikanga ine ine me nga tikanga ine tino.Ka taea te whakamahi inenga whanaunga ki te kite i te paanga o etahi tikanga maimoatanga ki te whakaaturanga ira, te kite i te rereketanga o te whakaaturanga ira i nga waa rereke me te whakataurite i te rereketanga o te whakaaturanga ira i roto i nga momo kopa.Ka taea e te ine tino kitea te nui o te waikawa nucleic i roto i te huaketo me etahi atu.I a tatou e mahi ana i nga whakamatautau, me whiriwhiri nga tikanga ine e tika ana kia rite ki a tatou ake whakamatautau.

Nga tikanga hoahoa tuatahi:

Ko te hoahoa o te tuatahi mo te qPCR e hono tika ana ki te kaha whakakaha me te motuhake o nga hua.No reira, ko te hoahoa tika i nga timatanga pai te mahi tuatahi mo te qPCR angitu.I roto i te hoahoa o te tuatahi, me aro ki nga maataapono e whai ake nei i te wa e tutuki ai te kaupapa o te hoahoa tuatahi:

1. Kei te whakahaeretia te roa o te kongakonga whaainga i waenga i te 100 me te 300 bp;

2. Te hoahoa whakawhiti-exon hei karo i te awe o te DNA genomic;

3. Me whakamatauria nga papa tuatahi mo te kaha o te whakakaha, a, ka eke te kaha whakakaha ki te paerewa (90-110%) ka taea te whakamahi mo nga whakamatautau ine;

4. I te nuinga o te wa ka arotauhia te kukū tuatahi i waenga i te 0.1uM me te 1.0uM.

Te whiriwhiringa oROX:

I roto i te tukanga o te tauhohenga ine, ka taea e ROX te whakatika i te rereketanga o te ara whatu, te hapa paipa, te rereketanga o te rōrahi i puta mai i te whakaetonga me te condensation riterite, te whakapai ake i te tukurua o nga hua.Engari, me tohu ko te kowhiringa o ROX e pa ana ki te taputapu.Mena kei te taputapu qPCR te mahi ki te whakatika aunoa i te rereketanga i waenga i nga rua, kaore e tika kia taapiri ROX;ki te kore, me taapiri te whakatika ROX.Ko nga hoa iti ki te hoko reagents me rite ki te taputapu i whakamahia hei whiriwhiri i te ROX tika, karohia nga hapa o muri mai.

Te whakarite i te punaha tauhohenga:

Ko nga pukapuka tauhohenga o te 20ul me te 50ul he pai ake.Ko nga mea e whai ake nei me aro ki te wa e hangaia ana te punaha:

1. Me whakarite te punaha tauhohenga ma te hau i roto i te papamahi ultra-ma, ddH hou₂Ka whakamahia te O mo ia whakamatautau;

2. Me whakarite e ia whakamatautau te NTC ki te manatoko mena he parahanga kei roto i te punaha, me mahi NTC ia takirua tuatahi ina whakarite ana i te punaha;

3. Hei kite mehemea he toenga gDNA kei roto i te tauira RNA, ka taea te whakarite NRT mo ia tauira kia kitea;

4. I te wa e whakarite ana i te punaha, ka tūtohu kia 3 nga mahi hangarau mo te tauira kotahi;

5. Ina he cDNA te tauira, ka tūtohu kia waimeha kia 5-10 nga wa hei whakaiti i te aukati o te punaha whakawhiti whakamuri i te whakamatautau qPCR.He pai ake te tuhura i te rahinga tauira ma te rōnaki, kia taka te uara CT i waenga i te 20-30;

6. Whakatauhia te maha o nga tauhohenga e hiahiatia ana, kia piki ake ma te 5-10% i runga i te maha o nga tauhohenga, me te tatau i te tau whirihoranga rōrahi;

7, kua rite te punaha ma te whakamahi i te kaupapa premix, te whakaranu i muri i te centrifugation me te whakarite kia kore he mirumiru;

8, Ka taea ki te whiriwhiri i nga taonga tautoko.

Kete RT-qPCR e pa ana