I whakawhanakehia te RT-qPCR mai i te hangarau PCR noa.Ka taapirihia nga matū korikori (waikano korikori, he rangahau kareoro ranei) ki te punaha tauhohenga PCR tuku iho, me te kite i te mahi whakamaarama me te toronga PCR i roto i te waa tuturu e ai ki o raatau momo rama.Ka whakamahia nga huringa tohu kareoro i roto i te reo ki te tatau i te nui o nga huringa hua i ia huringa o te PCR.I tenei wa, ko nga tikanga tino noa ko te tikanga waikano fluorescent me te tikanga tirotiro.

Tikanga tae korakora:
Ko etahi o nga waikano korikori, penei i te SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, me etahi atu, karekau e tuku marama i a ratou ano, engari ka tuku i te korakora i muri i te herenga ki te riu iti o te dsDNA.Na reira, i te timatanga o te tauhohenga PCR, kaore e taea e te miihini te kite i te tohu rewharewha.Ka puta te tauhohenga ki te toronga-rua (tikanga-rua-taahiraa) te waahi toronga ranei (tikanga e toru-taahiraa), ka whakatuwherahia nga whenu takirua i tenei wa, ka ko te DNA polymerase hou I te wa o te whakahiatotanga o te whenu, ka whakakotahihia nga ngota ngota rewharewha ki roto i te awaawa iti dsDNA me te whakaputa i te korakora.Ka piki ake te maha o nga huringa PCR, ka maha ake nga waikano e hono ana ki te dsDNA, me te whakanui tonu i te tohu rewharewha.Tangohia te SYBR Green Ⅰ hei tauira.
Tikanga tirotiro:
Ko te rangahau a Taqman te rangahau hydrolysis e whakamahia nuitia ana.He roopu korikori kei te pito 5′ o te tirotiro, ko te nuinga o te waa ko FAM.Ko te rangahau ano he raupapatanga ki te ira e whai ana.He roopu tinei kareoro kei te pito 3′ o te rewharewha.E ai ki te maataapono o te whakawhiti kaha o te resonance resonance (Förster resonance energy transfer, FRET), i te wa o te roopu resonance resonance pūngao (FRET), i te wa o te roopu resonance resonance (Förster resonance pūngao whakawhiti, FRET), i te wa e tata ana te kaikawe korero a te roopu resonance fluorescent me te roopu resonance fluorescent te tinei (whakaaetanga ngota fluorescent) I te wa e īnaki ana te tuāwhiorangi whakakorikori me te tawhiti e tata ana (7-10nm), ka taea e te whakakorikori o te ngota ngota kaikohikohiko te whakakorikori. kua oti.No reira, i te timatanga o te tauhohenga PCR, ina watea ana te tirotiro me te mau tonu i roto i te punaha, karekau te roopu kaikawe korero e whakaputa i te rewharewha.Ka herea ana, ka herea te tuatahi me te tirotiro ki te tauira.I te wa o te toronga, ka whakahiatotia e te polymerase nga mekameka hou.Ko te DNA polymerase he 5′-3′ mahi exonuclease.Ka tae atu ki te rangahau, ka whakamaarama e te polymerase DNA te rangahau mai i te tauira, ka wehea te roopu rekoata kairipoata mai i te roopu kareoro tineia, ka tuku i te tohu kareoro.I te mea he hononga kotahi ki te kotahi i waenga i te rangahau me te tauira, he pai ake te tikanga tirotiro i te tikanga tae i runga i te tika me te tairongo o te whakamatautau.

Fig 1 Te Tikanga o te qRT-PCR

Te hoahoa tuatahi
Tikanga:

Me hoahoa nga mea tuatahi ki roto i te rohe tiaki o te raupapa waikawa karihi me te mea motuhake.

He pai ake te whakamahi i te raupapa cDNA, ka whakaaetia hoki te raupapa mRNA.Ki te kore, tirohia te hoahoa rohe cds o te raupapa DNA.
Ko te roa o te hua ine ine korakora he 80-150bp, ko te roa rawa ko te 300bp, ko te roanga tuatahi kei waenga i nga turanga 17-25, a ko te rereketanga i waenga i nga papaaa whakarunga me o raro kia kaua e nui rawa.

Ko te ihirangi G+C kei waenga i te 40% me te 60%, me te 45-55% te mea pai.
Ko te uara TM kei waenga i te 58-62 nga nekehanga.
Me ngana ki te karo i nga dimer tuatahi me nga riima-whaiaro, (kaore e nui ake i te 4 nga takirua o nga turanga taapiri karapīpiti) te hanganga makawe, ki te kore e taea te karo, hanga ΔG<4.5kJ/mol* Ki te kore e taea e koe te whakarite kua tangohia te gDNA i te wa o te whakawhiti whakamuri Maama, he pai ki te hoahoa i nga timatanga o te intron *3′ te mutunga ka kore e taea te karo i nga hanganga AT, 3′ me te rohe whai rawa ki te karo AT, G/GC. ) nga mea tuatahi me te kore-
motuhake Ko te homology o te raupapa whakahiatotanga he pai ake i te iti iho i te 70%, he 8 ranei te homology turanga taapiri.
Pātengi Raraunga:
CottonFGD rapu ma nga kupumatua
hoahoa tuatahi:
IDT-qPCR hoahoa tuatahi

Fig2 IDT wharangi taputapu hoahoa tuatahi ipurangi

Fig3 whakaaturanga wharangi hua
Hoahoa o te lncRNA tuatahi:
lncRNA:he rite nga hikoinga ki te mRNA.
miRNA:Ko te maataapono o te tikanga kakau-koropiko: I te mea he raupapa poto nga miRNA katoa e tata ana ki te 23 nt, kare e taea te kimi PCR tika, na reira ka whakamahia te taputapu raupapa kakau-koropiko.Ko te raupapa kakau-kopiko he DNA whenu-tahi o te 50 nt, ka taea e ia te hanga i te hanga makawe maana anake.3 'Ko te mutunga ka taea te hoahoa hei raupapa taapiri ki te wahanga wahanga miRNA, katahi ka taea te hono te miRNA whainga ki te raupapa kakau-koropiko i te wa o te whakawhiti whakamuri, a ka tae te roa katoa ki te 70bp, e rite ana ki te roa o te hua whakakaha kua whakatauhia e te qPCR.Tailing miRNA hoahoa tuatahi .
Rapunga whakakaha-motuhake:
Putunga putunga ipurangi: CottonFGD pupuhi ma te raupapa raupapa
Te pupuhi o te rohe: Tirohia te whakamahi Blast+ ki te mahi puhipuhi o te rohe, ka taea e linux me nga macos te whakatu i tetahi putunga raraunga rohe, ka taea hoki te punaha win10 i muri i te whakaurunga o te ubuntu bash.Waihangahia te putunga putunga o te rohe me te pupuhi o te rohe;whakatuwhera ubuntu bash i runga i te win10.
Panui: Ko te miro o uta me te miro o te moutere o te moana he hua tetraploid, no reira ko te hua o te pupuhi he maha nga wa e rua, neke atu ranei nga keemu.I nga wa o mua, ko te whakamahi i nga cd NAU hei putunga korero ki te mahi pupuhi ka kitea e rua nga ira homologous he iti noa nga rereketanga SNP.I te nuinga o te waa, kaore e taea te wehe i nga ira homologous e rua ma te hoahoa tuatahi, no reira ka rite tonu.Mena ka kitea he indel, ka hangaia te tuatahi ki runga i te indel, engari ka arahi pea tenei ki te hanganga tuarua o te tuatahi Ka piki ake te kaha kore utu, ka heke te kaha o te whakakaha, engari kaore e taea te karo.

Te kitenga o te hanganga tuarua tuatahi:
Hipanga:tuwhera te oligo 7 → raupapa tauira whakauru → kati te matapihi-iti → tiaki → kimihia te tuatahi o te tauira, pehia te ctrl+D hei tautuhi i te roa o te tuatahi → te tātari i nga momo hanganga tuarua, penei i te tinana dimerization, heterodimer, hairpin, mismatch, etc.He pai te hua o te tuatahi o mua, karekau he ahua dimer me te hanga makawe makawe, karekau he turanga taapiri tonu, a ko te uara tino o te kaha kore utu he iti iho i te 4.5, i te mea kei te whakaatu tonu te papamuri o muri Ko nga turanga 6 he taapiri, ko te kaha kore utu he 8.8;i tua atu, ka puta mai he dimer tino taumaha ki te pito 3′, ka puta mai he dimer o nga turanga karapīpiti e 4.Ahakoa kaore i te teitei te kaha kore utu, ko te 3′ dimer Chl ka tino pa ki te motuhake o te whakakaha me te pai o te whakakaha.I tua atu, he mea tika ki te tirotiro mo nga makawe makawe, he heterodimers, me nga rereke.

Fig3 oligo7 hua kitenga
Te rapunga kaha whakakaha:
Ko te kaha whakakaha o te tauhohenga PCR ka tino pa ki nga hua PCR.I roto ano i te qRT-PCR, he mea nui te kaha o te whakakaha mo nga hua ine.Tangohia etahi atu matū, mihini me nga tikanga i roto i te parepare tauhohenga.He nui te awe o te kounga o nga mea tuatahi ki te kaha whakakaha o te qRT-PCR.Hei whakapumau i te tika o nga hua, ko te inenga rerewharewha whanaunga me te ine rewharewha tino tika me kite i te pai o te whakakaha o nga timatanga.E mohiotia ana ko te kaha o te whakakaha qRT-PCR i waenga i te 85% me te 115%.E rua nga tikanga:
1. Tikanga ānau paerewa:
a.Whakaranuhia te cDNA
b.Rōnaki waimeha
c.qPCR
d.Te whārite whakahekenga rārangi hei tātai i te kaha whakakaha
2. LinRegPCR
He kaupapa a LinRegPCR mo te tātaritanga o nga Raraunga RT-PCR i te waa tuturu, e kiia ana ko te raraunga PCR ine (qPCR) i runga i te SYBR Green, matū rite ranei.Ka whakamahi te papatono i nga raraunga whakatika-kore, ka mahi i te whakatikatika i runga i ia tauira ka wehea, ka whakatau i te matapihi-o-rarangi, ka whakamahi i te wetewete whakamuri raina kia uru ki te raina tika ma te huinga raraunga PCR.Mai i te titahatanga o tenei raina ka tatauhia te kaha PCR o ia tauira takitahi.Ko te tikanga o te kaha PCR mo ia amplicon me te uara Ct mo ia tauira ka whakamahia hei tatau i te kuhanga timatanga mo ia tauira, e whakaatuhia ana i roto i nga waeine fluorescence.Ko te whakauru me te whakaputanga raraunga na roto i te ripanga Excel.Tauira anake
ka hiahiatia te ranu, kaore he rōnaki
e hiahiatia ana nga taahiraa:(Tangohia te Bole CFX96 hei tauira, ehara i te Miihini tino marama te ABI)
whakamātau:he whakamatautau qPCR paerewa.
Putanga raraunga qPCR:Ka taea e LinRegPCR te mohio ki nga ahuatanga e rua o nga konae whakaputa: RDML, ine ranei te hua Whakanuia.Ko te mea pono, ko te uara kitenga o te tau hurihanga me te tohu rewharewha e te miihini, a ka whiwhi te whakakaha ma te tātari i te uara huringa o te reanga o te kakama o te wahanga raina.
Te kowhiringa raraunga: I roto i te ariā, me whakamahi te uara RDML.E kiia ana ko te raru o taku rorohiko ko te kore e taea e te rorohiko te mohio ki te RDML, no reira kei a au te uara putanga Excel hei raraunga taketake.E taunaki ana kia mahia he tirotiro taratara o nga raraunga i te tuatahi, penei i te kore o te taapiri i nga tauira, me era atu. Ka taea te whakakore i nga tohu i roto i nga raraunga whakaputa (ko te tikanga, kaore e taea e koe te whakakore, ka warewarehia e LinRegPCR enei tohu i te waahanga o muri mai)

Fig5 qPCR kaweake raraunga

Fig6 te kowhiringa o nga tauira kaitono

Whakauru Raraunga:Whakatuwherahia nga hua whakanui tohu.xls, → whakatuwhera LinRegPCR → konae → panui mai i te Excel → tohua nga tawhā e whakaatuhia ana i te Whakaahua 7 → OK → paatohia te whakatau i nga rarangi turanga

Fig7 nga hikoinga o te whakauru raraunga linRegPCR

Hua:Mena karekau he tukurua, karekau he whakarōpūtanga.Mēnā he tukurua, ka taea te whakarōpūtanga i roto i te tauira whakarōpūtanga, ā, ka tāuruhia te ingoa o te ira ki te pūtāutu, kātahi ka whakarōpū aunoatia taua ira.Ka mutu, pawhiria te konae, kaweake te Excel, ka tirohia nga hua.Ka whakaatuhia te kaha whakakaha me nga hua R2 o ia puna.Tuarua, ki te wehewehe koe ki nga roopu, ka whakaatuhia te kaha o te whakakaha toharite whakatika.Me whakarite kei waenga i te 85% me te 115% te kaha whakakaha o ia pukapuka tuatahi.Mena he nui rawa, he iti rawa ranei, ko te tikanga he ngoikore te kaha o te whakakaha o te tuatahi.

Fig 8 Hua me te putanga raraunga

Te tukanga whakamatautau:
Nga whakaritenga kounga RNA:
Pure:1.7Ko te 2.0 e tohu ana tera pea te toenga o te isothiocyanate.Ko te waikawa karihi pokekore A260/A230 me tata ki te 2 .Mehemea he kaha te whakaurunga i te 230 nm, e tohu ana tera ano nga puhui waro penei i nga katote phenate.I tua atu, ka taea te kitea e te 1.5% agarose gel electrophoresis.Tohua te tohu, na te mea karekau he denaturation o te ssRNA, a, karekau he hononga raina o te taunga ngota ngota, a kaore e taea te whakaatu tika i te taumaha ngota.Te Kukunga: Tikangakaoreiti iho i te 100ng/ul, ki te he iti rawa te kukū, ko te tikanga iti te ma kore teitei

Whakaahua 9 RNA gel

I tua atu, ki te mea he utu nui te tauira me te nui o te kukū RNA, e tūtohu ana ki te aliquot i muri i te tangohanga, me te waimeha i te RNA ki te kukū whakamutunga o 100-300ng / ul mo te whakawhiti whakamuri.I rotote tukanga whakawhiti whakamuri, i te wa e tuhia ana te mRNA, ka whakamahia nga oligo (dt) tuatahi ka taea te here ki nga hiku polyA mo te whakawhiti whakamuri, i te mea ko te lncRNA me te circRNA e whakamahi ana i nga hexamer matapōkere (Random 6 mer) tuatahi mo te whakawhitinga whakamuri o te RNA katoa Mo te miRNA, ka whakamahia te miRNA-specific neck-loop primers mo te whakawhitinga whakamuri.He maha nga kamupene kua whakarewahia he kete tailing motuhake.Mo te tikanga o te kakau, he pai ake te tikanga o te hiku, he nui te whakaputa, me te whakaora i te reagent, engari Ko te painga o te wehewehe i nga miRNA o te whanau kotahi kia kaua e rite ki te tikanga o te kakau.Kei ia kete tuhi whakamuri he whakaritenga mo te kukū o nga ira-a-ira-a-ira (nga kopikopiko).Ko te tohutoro o roto mo te miRNA ko U6.I roto i te tukanga o te hurihanga kakau-koropiko, me whakataka motuhake te ngongo U6, me te taapiri tika i te mua me te tuara o te U6.Ka taea e te circRNA me te lncRNA te whakamahi i nga HKG hei tohutoro o roto.I rotote kitenga cDNA,
ki te kore he raruraru ki te RNA, me pai ano te cDNA.Heoi, ki te whaia te tino pai o te whakamatautau, he pai ake te whakamahi i te ira tohutoro o roto (Reference gene, RG) ka taea te wehewehe i te gDNA mai i nga cd.Ko te tikanga, he ira tiaki whare a RG., HKG) e whakaatuhia ana i te Whakaahua 10;I taua wa, kei te mahi ahau i te pūmua rokiroki soybean, me te whakamahi i te actin7 kei roto nga introns hei tohutoro o roto.Ko te rahi o te kongakonga kua whakanuia o tenei tuatahi i roto i te gDNA he 452bp, a mena ka whakamahia te cDNA hei tauira, he 142bp.Na ka kitea e nga hua whakamatautau ko tetahi Wāhanga o te cDNA i pokea e te gDNA, me te whakaatu hoki karekau he raru ki te hua o te tuhi whakamuri, ka taea te whakamahi hei tauira mo te PCR.Karekau he painga ki te whakahaere tika i te electrophoresis gel agarose me te cDNA, a he roopu diffuse, kaore i te tino whakapono.

Fig 10 te kitenga cDNA

Te whakatau i nga tikanga qPCRKo te tikanga karekau he raru e ai ki te kawa o te kete, ko te nuinga o te waa o te uara tm.Ki te kore e pai te hoahoa o etahi papa tuatahi i te wa o te hoahoa tuatahi, ka puta he rereketanga nui i waenga i te uara tm me te ariā 60°C, e taunaki ana kia cDNA I muri i te ranu o nga tauira, whakahaere i te PCR rōnaki me nga kaimatai, ka ngana ki te karo i te whakatakoto i te pāmahana kaore he here hei uara TM.

Te tātari raraunga

Ko te tikanga tukatuka PCR ine rewharewha inenga tikanga e rite ana ki te 2-ΔΔCT.tauira tukatuka raraunga.

Hua e Pa ana:

PCR Wā Tuturu He ngawari^TM —Takamana

PCR Wā Tuturu He ngawari^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix mo te whenu tuatahi cDNA synthesis)

RT Easy II(Master Premix mo te whenu tuatahi cDNA synthesis mo qPCR)