Te whakamaoritanga o nga tohutohu paipa me nga ngongo EP, aha atu.

1. Whakapaia te 0.1% (kotahi haumano) DEPC (he mea tino paitini) me te wai kua whakakorehia, kia ata whakamahia ki roto i te kohu kohu, ka penapena ki te 4°C tawhiti atu i te marama;

Ko te wai DEPC he wai parakore kua tukinotia ki te DEPC ka whakahoroa e te pāmahana teitei me te pehanga teitei.I whakamatauria kia kore he RNase, DNase me te pūmua.

2. Whakanohoia te pito paipa me te ngongo EP ki te 0.1% DEPC, me te whakarite kia whakakiia te pito paipa me te ngongo EP ki te 0.1% DEP.

3. Tiakina mai i te marama, waiho kia tu, mo te po (12-24h)

4. Ko te pouaka kei roto te pito me te ngongo EP kaore e hiahiatia kia rukuhia ki te DEPC.I muri tata i te tango i te wai DEPC i roto i te pito, i te ngongo EP ranei, kohia ki runga ka takai.

5. 121 nga nekehanga Celsius, 30 min

6. 180 nga nekehanga Celsius, maroke mo etahi haora (i te iti rawa 3 haora)

Tuhipoka: a.Kia mau i nga karapu taherapa me nga kanohi kanohi i te wa e whakahaere ana i te DEPC!b, karekau ranei te whakakorikori DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (he maha nga taiwhanga whakawera wera teitei e rua nga wa)

Nga whakaaro tangohanga RNA

E rua nga ahuatanga nui o te korenga o te wehenga RNA kiko

Te whakahekenga o te RNA me nga toenga o nga poke i roto i nga kopa,mo te paheketanga, me titiro tuatahi tatou he aha te RNA i tangohia mai i nga momo tipu kaore e ngawari ki te whakaheke.Ko nga reagents tangohanga RNA o naianei kei roto katoa nga waahanga ka tere te aukati i te RNase.Tāpirihia te lysate ki ngā pūtau kua whakatipuria, ka uru noa, ka taea te whakakotahi i nga pūtau katoa ki te lysate, ka lysate katoa nga pūtau.I muri i te whakahekenga o nga pūtau, ko nga kai kaha o te lysate ka aukati tonu i te RNase intracellular, na reira ka mau tonu te RNA.Ko te tikanga, na te mea he ngawari, he ngawari hoki te whakapiri atu ki te lysate, kare o ratou RNA i te whakaheke ngawari;i tetahi atu taha, ko te RNA i roto i te kiko ka ngawari te whakaheke na te mea kaore i te ngawari nga pūtau i roto i te kiko ki te whakapiri wawe ki te lysate.na te nui o te whakapiri.Na,ki te whakaaro he huarahi hei huri i te kiko ki roto i te pūtau kotahi i te wa e aukati ana i te mahi RNA, ka taea te whakaoti katoa te raru o te whakahekenga.

Ko te mira hauota wai te tikanga tino whai hua.Heoi, he tino raruraru te tikanga mira hauota wai, ina koa ka nui te maha o nga tauira.Na tenei i puta ake te mea pai e whai ake nei: ko te homogenizer.Ko tehomogenizerKarekau te tikanga e whakaaro ki te patai me pehea te aukati i te mahi RNase i mua i te whakapiringa o nga pūtau ki te lysate, engari me inoi kia tere ake te tere o te pakaru o te kiko i te tere o te RNase intracellular e whakaheke ana i te RN.

He pai ake te painga o te homogenizer hiko,a he rawakore te painga o te homogenizer karaihe, engari i te nuinga o te waa, kaore e taea e te tikanga homogenizer te aukati i te ahuatanga whakaheke.Na, ki te whakahekehia te tangohanga, me whakamahi te homogenizer hiko taketake mo te huri ki te hauota wai;kia huri te homogenizer karaihe taketake ki te homogenizer hiko ranei tika mira ki te hauota wai.Ko te raruraru he tata ki te 100% ka taea.whakatau.

He maha ake nga take kanorau o te toenga poke e pa ana ki nga whakamatautau o muri mai i te paheketanga, he rereke nga otinga.Hei whakamutunga,ki te mea he paheketanga, he toenga poke ranei kei roto i te kiko, me arotau te tikanga tangohanga/whakauru mo te rawa whakamätautau motuhake.Kaore koe e whakamahi i o tauira utu nui mo te arotautanga: ka taea e koe te hoko i etahi kararehe iti penei i te ika/heihei mai i te maakete, tangohia te waahanga o te rauemi mo te tangohanga RNA, me tetahi atu waahanga mo te tangohanga pūmua – huri ki te waha, te puku me te whekau.

Ko te RNA whainga o te RNA kua tangohia ka whakamahia mo nga whakamatautau whai muri, a he rereke nga whakaritenga o te kounga

Ko te hanga whare pukapuka cDNA me tika te RNA me te kore he toenga o te aukati tauhohenga enzyme;Ko te Raki e hiahia ana kia teitei ake te pono o te RNA me nga whakaritenga iti mo nga toenga aukati tauhohenga enzyme;Kaore e hiahiatia e te RT-PCR te RNA teitei rawa,engari ka aukati i nga tauhohenga o te enzyme.He kaha nga whakaritenga toenga.Ko te whakauru ka whakatau i te putanga;i nga wa katoa ko te whainga kia whiwhi i te RNA parakore teitei, ka pau te utu mo te tangata me te moni.

Kohinga / Rokiroki o Tauira

Nga take e pa ana ki te paheketanga I muri i te mawehenga o te tauira i te tinana ora/te taiao tupu taketake ranei, ka timata nga enzymes endogenous i roto i te tauira ki te whakaheke i te RNA,ā, e pā ana te tere o te whakaheke ki te ihirangi o te whākōkī me te pāmahana.I nga wa o mua, e rua noa nga huarahi hei aukati i te mahi o te whaariki endogenous: taapirihia te lysate i te wa tonu ka whakakotahi kia tere me te tere;tapahia ki nga wahi iti, ka whakatio tonu i roto i te hauota wai.Ko nga huarahi e rua me mahi tere.Ko te mea whakamutunga he pai mo nga tauira katoa, ko te mea o mua e tika ana mo nga kopa he iti te ihirangi o nga pūtau me nga enzymes endogenous me te ngawari ki te whakakotahi.Inaa, ko te kiko o te tipu, te ate, te thymus, te pancreas, te kiko, te roro, te ngako, te kiko uaua, me etahi atu, he pai ake te whakatoo ki te hauota wai i mua i te haere.

Te wehewehe me te whakakotahitanga o nga tauira

Nga take e pa ana ki te paheketanga me te hua ko te wehenga tauiramo te tino homogenization, he mea mo te tuku oti me te tuku katoa o te RNA.Ka taea te whakakotahi tika i nga pūtau me te kore e pakaru.Ka taea te whakakotahi i nga kopa i muri i te pakaru.Me whati te rewena me te huakita ki nga whākōkī e hāngai ana i mua i te whakakotahitanga.Ko nga kopa me te iti ake o te ihirangi enzyme endogenous me te homogenization ngawari ake ka taea te kuru me te whakakotahi i te wa kotahi i roto i te lysate e te homogenizer;te kiko tipu, ate, thymus, pancreas, spleen, roro, ngako, kiko uaua me etahi atu tauira, He nui i roto i nga enzymes endogenous, kaore ranei i te ngawari te whakakotahi,no reira me mahi motuhake te whakararu o te kiko me te homogenization.Ko te tikanga tino pono me te whai hua o te wehewehenga ko te mira ki te hauota wai, a ko te tikanga tino pono o te homogenization ko te whakamahi i te homogenizer hiko.He korero motuhake mo te mira me te hauota wai: kaua e whakamaroke te tauira i te wa katoa o te mira, i te mea ka kaha ake te mahi o nga whaariki endogenous ina tio ana.

Kōwhiringa o te lysate

Ka pa ki te waatea o te mahi me nga ahuatanga o te toenga o nga parakore o roto Ko nga otinga lysis e whakamahia ana ka tata te aukati i te mahi a RNase.Na reira, ko te kaupapa matua o te kowhiri i te otinga lysis ko te whakaaro tahi me te tikanga purenga.He rereke tetahi:Ko nga tauira he nui te ihirangi o te enzyme endogenous e taunaki ana ki te whakamahi i te lysate kei roto phenol hei whakanui ake i te kaha ki te whakakore i nga enzyme endogenous.

Kōwhiringa o te tikanga purenga

Ko nga mea e pa ana ki te toenga o nga poke o roto, te tere tangohanga Mo nga tauira maamaa penei i nga pūtau, ka taea te whiwhi hua pai me te tata o nga tikanga purenga kei a koe.Engari mo te maha atu o nga tauira, ina koa ko te hunga he nui nga poke penei i te tipu, ate, huakita, aha atu, he mea nui te whiriwhiri i tetahi tikanga purenga.Ko te tikanga purenga centrifugal pou he tere tangohanga tere, ka taea te tango i nga poke e pa ana ki te tauhohenga enzymatic o muri mai o te RNA, engari he utu nui (Ka taea e Foregene te tuku kete utu-utu, he panui atu nga korero.konei);te whakamahi i nga tikanga ohaoha me nga tikanga purenga matarohia, penei i te rerenga LiCl, ka taea hoki te whiwhi hua pai, engari he roa te wa mahi..

"E Toru Nga Akoranga me te Waru Mahinga" mo te Tangohanga RNA

Akoranga 1:Whakamutua te poke o nga whākōkī o waho.

Tuhipoka 1:Kia mau ki nga kanohi kanohi me nga karapu.

Tuhipoka 2:Ko nga ngongo centrifuge, nga upoko Tip, nga rakau paipa, nga taika electrophoresis, me nga taumanu whakamatautau e uru ana ki te whakamatautau me tino whakakorehia.

Tuhipoka 3:Ko nga reagents/rongoa e uru ana ki te whakamatautau, ina koa ko te wai, me noho kore he RNase.

Akoranga 2:Aukati i te mahi o nga enzymes endogenous

Tuhipoka 4:Kōwhiria he tikanga whakamohoatanga e tika ana.

Tuhipoka 5:Kōwhirihia he lysate e tika ana.

Tuhipoka 6:Whakahaerehia te rahinga timatanga o te tauira.

Akoranga 3:Whakamaramahia to kaupapa tangohanga

Tuhipoka 7:Ki tetahi punaha lysate e tata ana ki te nui o te timatanga o te tauira, ka tino heke te reiti angitu tangohanga.

Tuhipoka 8:Ko te paearu ohaoha anake mo te tangohanga RNA angitu he angitu i roto i nga whakamatautau ka whai ake, ehara i te tuku.

Top 10 Puna o RNase Contamination

1. Ko nga maihao te puna tuatahi o nga whaakiki o waho, no reira me mau nga karapu me te whakakapi i nga wa katoa.I tua atu, me mau ano nga kanohi kanohi, na te mea he puna nui ano te manawa o nga whaa.Ko tetahi atu painga o te mau maru karapu he whakamarumaru i te kaiwhakamatautau.

2. Nga tohutohu pipette, ngongo centrifuge, pipettes - Kaore e taea te whakakore i te RNase ma te whakakorikori anake, no reira me rongoa nga tohutohu pipette me nga ngongo centrifuge ki te DEPC, ahakoa kua tohua hei DEPC.He pai ake te whakamahi i te pipette kaupapa motuhake, horoia ki te 75% te waipiro miro poroporo i mua i te whakamahi, ina koa te rakau;i tua atu, kia kaua e whakamahi i te tango upoko.

3. Me noho kore te wai/buffer i te poke RNase.

4. I te iti rawa me muru te teepu whakamatautau ki te 75% o nga poro miro waipiro.

5.Endogenous RNase Kei roto i nga kopa katoa nga enzymes endogenous, no reira ko te whakatio tere o nga kopa me te hauota wai te huarahi pai hei whakaiti i te paheketanga.Ko te tikanga mo te penapena hauota wai/whakahuri he tino rawe, engari koinei anake te huarahi mo nga kopa he nui te taumata o nga whaariki endogenous.

6. Tauira RNA Kei roto pea i nga hua tangohanga RNA etahi tohu o te parahanga RNase.

7. Te tangohanga Plasmid He maha nga wa ka whakamahia e te tangohanga plasmid te Rnase ki te whakaheke i te RNA, ko te toenga o te Rnase me keri me te Proteinase K ka tangohia e te PCI.

8. Te rokiroki RNA Ahakoa ka penapenahia ki te iti o te pāmahana, ko te nui o te RNase ka paheke te RNA.Ko te otinga pai mo te pupuri i te RNA mo te wa roa ko te whakatārewatanga o te tote/waipiro, na te mea ka aukati te waipiro i nga mahi enzymatic katoa i nga wera iti.

9. Ina kei roto nga katote (Ca, Mg) i enei katote, ko te whakamahana i te 80C mo te 5 meneti ka pakaruhia te RNA, na, ki te hiahia te RNA ki te whakamahana, me whakauru te otinga tiaki i tetahi kaihoko chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).

10. Ko nga enzymes e whakamahia ana i nga whakamatautau ka whai ake ka pokea e te RNase.

10 Tohutohu mo te Tangohanga RNA

1: Kia tere te aukati i te mahi RNase.Ka tere te whakatotoka o nga tauira i muri i te kohi, ka kore te RNase e whakahoahohia e te mahi tere i te wa o te lysis.

2: Whiriwhiria he tikanga tangohanga e tika ana mo te kiko he nui te ribozyme ihirangi, a ko te kiko adipose he pai ake te whakamahi i te tikanga kei roto te phenol.

3: Ko te kounga matapae e hiahia ana ki te Raki, ko te hanga whare pukapuka cDNA me tino tika, me te RT-PCR me te RPA (Ribonuclease protection assay) e kore e hiahia kia tika.Ko te RT-PCR e hiahia ana kia tino parakore (nga toenga aukati enzyme).

4: Ko te tino homogenization te mea matua ki te whakapai ake i te hua me te whakaiti i te paheketanga.

5: Tirohia te tika o te rapunga hiko RNA, 28S: 18S = 2: 1 he tohu katoa, 1: 1 ka whakaaetia mo te nuinga o nga whakamatautau.

6: Te tango i te DNA mo te RT-PCR, te wetewete huinga He pai ake te whakamahi i te Dnase I hei tango i te DNA.

7: Whakaitihia te poke o nga enzymes o waho – e kore e taea te kawemai mai i waho.

8: I te wa e whakakorikori ana te waikawa karihi iti, me taapiri he reagent paheketanga.Engari ki te aukati i te hautahi e mau ana i nga whaariki me te poke DNA.

9: Whakangaromia te RNA, mehemea e tika ana, whakamahana ki te 65C mo te 5 meneti.

tikanga rokiroki pai

Ka taea te penapena ki te -20C mo te wa poto, me te -80C mo te wa roa.Ko te mahi tuatahi ki te whakapai ake i nga hua RNA ko te mohio he rereke nga momo RNA o nga tauira rereke.Ko te nui o te nui (2-4ug/mg) penei i te ate, te pancreas, te ngakau, te nui o te reo (0.05-2ug/mg) penei i te roro, te embryo, te whatukuhu, te huhu, te thymus, te ovary, te iti o te nui (<0.05ug/mg) mg) penei i te pukupuku, te wheua, te ngako.

1: Lyse pūtau ki te tuku RN - ki te kore e tukuna te RNA, ka heke te hua.He pai ake te mahi o te whakakotahitanga hiko i etahi atu tikanga whakamohoatanga, engari me hono ano ki etahi atu tikanga, penei i te hauota hauota mashing, te nakunaku enzymatic (Lysozyme/Lyticase)

2: Te arotautanga o te tikanga tangohanga.Ko nga raruraru nui rawa atu me nga tikanga phenol-a-te-whenol ko te whakaroputanga kaore i oti me te ngaronga RNA waahanga (kaore e taea te tango katoa te supernatant).Ko te stratification kaore i oti na te nui o te waikawa nucleic me te ihirangi pūmua, ka taea te whakatau ma te whakanui ake i te nui o te lysate e whakamahia ana, te whakaiti ranei i te nui o te tauira.I taapirihia he waahanga tangohanga chloroform ki te kiko adipose.Ka taea te whakaheke i te mate RNA ma te pana-muri, ma te tango ranei i te paparanga waro ka whai i te centrifugation.Ko te raru nui rawa atu me nga tikanga e pa ana ki te centrifugation ko te taikaha tauira.

Tohutohu Tangohanga Tauhira

1. Te pure Phenol: Tāpirihia he rōrahi rite o te 1:1 Phenol/Chloroform ka uru kaha mo te 1-2 meneti.Whakanuia ki te tere tere mo te 2 meneti.Ata tango i te supernatant (80-90%).Kaua rawa e tae ki te paparanga waenga.Ka taea te taapiri i te rōrahi rite o te otinga tauhohenga ki te Phenol/Chloroform ka tangohia te supernatant.Ka taea te whakakotahi i nga supernatants e rua mo te rerenga waikawa karihi hei whakapai ake i te hua.Kaua e ngawari rawa ina ranu, kaua hoki e ngana ki te tango i te supernatant katoa.

2. Te horoi ki te 70-80% te waihano: I te wa e horoi ana, me whakatarewa te waikawa karihi kia horoia te toenga o te tote.I te wa ano, i muri tonu i te ringihanga atu i te waihano, whakahiatohia ki te tere tere mo etahi hēkona, katahi ka tango i te toenga waihano me te pipette.Whakarewa i muri i te tu i te pāmahana rūma mo te 5-10 meneti.

11. Tangohanga o nga whakahaere motuhake

1. Te kiko kiko: Ko te mea nui ki te tangohanga RNA mai i te kiko kiko penei i te uaua ngakau/skeletal ko te tino whakararu i te kiko.He iti te kiato pūtau o enei kopa, no reira he iti te nui o te RNA mo ia waeine taumaha o te kiko, a he pai ake te whakamahi i te nui o te timatanga ka taea.Me tino huri te kiko i raro i nga tikanga mīti.

2. Ko nga kopa he nui te pūmua/ngako: he nui te ngako o te roro/huawhenua.Whai muri i te tangohanga PCI, kei roto i te supernatant he kahui ma.Me tango ano te supernatant ki te chloroform.

3. Ko nga kopa he nui te waikawa nucleic/ribozyme: he nui te waikawa karihi me te ribozyme o te spleen/thymus.Ko te huri i te kiko i raro i nga tikanga mīti ka whai i te homogenization tere ka taea te whakakore i nga ribozymes.Engari, ki te mea he tino pokarekare te lysate (na te nui o te waikawa nucleic acid), ka kore e taea e te tangohanga PCI te stratify pai;Ko te taapiri atu i te lysate ka taea te whakatau i tenei take.Ka taea e nga tangohanga PCI maha te tango atu i nga toenga DNA.Mena ka puta mai he kohu ma i muri tonu mai i te taapiri waipiro, he tohu te poke DNA.Ko te tango ano me te PCI waikawa i muri i te whakakorenga ka taea te tango i te poke DNA.

4. Te kiko tipu: He uaua ake te kiko o te tipu i te kiko kararehe.Ko te tikanga, ka kuia nga tipu i raro i nga tikanga hauota wai, no reira kare noa iho te paheketanga o te RNA e nga enzymes endogenous.Mena kaore i whakatauhia te raru o te whakahekenga, ka tata te take na nga poke kei roto i te tauira.Ko nga poke kei roto i te maha o nga tipu ka arahi ki nga toenga, a ko te take o nga toenga ko te mea he rite etahi o enei poke ki te RNA: ka heke koe, ka heke ahau, ka uru koe, ka uru ahau.Ko enei ahuatanga e whakatau ana he tino kaha te aukati i te enzyme.

I tenei wa, ka taea te urutau nga reagents tangohanga RNA arumoni ki te tata ki nga kopa kararehe katoa me nga whakatikatika iti, engari he iti noa nga reagents tangohanga RNA arumoni e tika ana mo te nuinga o nga kopa tipu.Waimarie, ka taea e Foregene te whakarato motuhaketipu RNA kete tangohanga, kei a matouTipu Tapeke RNA Wehewehenga kete, Tipu Tapeke RNA Wehewehe kete Plus.Ko te mea whakamutunga he mea hanga motuhake mo nga tipu he nui te polysaccharide me te ihirangi polyphenol.Mo te tangohanga RNA, he tino pai nga urupare a nga kaiwhakamahi taiwhanga.

12. Te painga o te tauira mīti me te whakamaroke He nui ake pea te tauira tio, me tapahi i mua i te whakamahi mo te tangohanga RNA.Ko nga tauira ka rewa (tetahi waahanga pea) i te wa e tapahi ana.Me paunatia pea nga tauira tio i mua i te tangohanga o te RNA, a ka tino rewa i roto i tenei mahi.I etahi wa, ka puta ano te whakamaroketanga o te tauira i te wa o te mira hauota wai;ranei te tauira tio te hono tika ki te lysate kahore wai hauota mira, a ka tino puta te rewa i mua i te homogenization oti.Kua kitea e nga whakamatautau he kaha ake te paheketanga o te kiko tio ki te RNA i te wa e rewa ana i te kiko hou.Ko te take pea: Ko te mahi whakatio-rewa ka whakararu i nga hanganga i roto i te pūtau, ka ngawari ake te uru atu o nga whaariki endogenous ki te RNA.

13. Te whakatau i te kounga o te RNA I te nuinga o te waa, ka whakamahia te electrophoresis ki te whakatau i te pono o te RNA, ka whakamahia te A260/A280 hei whakatau i te ma o te RNA.I roto i te ariā, he ōwehenga 28S:18S = 2.7:1 te RNA mau tonu, a ko te nuinga o nga raraunga e whakanui ana i te ōwehenga o te 28S:18S = 2:1.Ko te meka ko te mea kaore tetahi o nga RNA i tangohia mai i nga tauira i tua atu i nga pūtau kei roto i te 2: 1 ōwehenga (i whiwhihia tenei ma te Agilent Bioanalyzer).

Ko nga hua electrophoresis o te RNA e pa ana ki te maha o nga mea, tae atu ki te hanganga tuarua, nga tikanga electrophoresis, te utaina tauira, te tohu o te waiwai o te EB, me era atu.Mena he maamaa te 28S i te 2kb me te 18S i te 0.9kb, me te 28S: 18S > 1, ka taea e te tapatahi te whakatutuki i nga whakaritenga o te nuinga o nga whakamatautau ka whai ake.

Ko te A260/A280 he tohu kua nui te rangirua.Tuatahi, he mea tika ki te whakamarama i te tikanga taketake o tenei tohu mo nga waikawa karihi: RNA parakore, tona A260/280 = mo te 2.0.Ko te RNA parakore te 'take' ko A260/A280 = 2 te 'hua'.Inaianei kei te whakamahi nga tangata katoa i te A260/A280 hei 'take', me te whakaaro "mehemea A260/A280 = 2, he parakore te RNA", ka puta te rangirua.

Mena kei te hiahia koe, ka taea e koe te taapiri i tetahi reagent iti e whakamahia ana i te tangohanga, penei i te phenol, guanidine isothiocyanate, PEG, me etahi atu, ki to tauira RNA, ka ine i te tauwehenga A260/A280.Ko te mea pono ko te maha o nga reagents e whakamahia ana mo te tangohanga RNA, me te maha o nga poke i roto i te tauira, ka uru ki te taha o A260 me A280, ka pa ki te A260/A280.

Ko te huarahi tino ako i tenei wa ko te matawai i nga tauira RNA i te awhe 200-300 nm.Ko te pihi o te RNA parakore ko nga ahuatanga e whai ake nei: he maeneene te pihi, A230 me A260 e rua nga tohu whakawhiti, A300 e tata ana ki te 0, A260/A280 = huri noa i te 2.0, me A260/A230 = huri noa i te 2.0.Mena karekau he raraunga matawai, me whakatau ano te tauwehenga A260/A230, i te mea he tairongo ake tenei owehenga ki te kawe i nga poke katoa e pa ana ki te tauhohenga enzymatic.Whakaarohia te awhe raina o te taputapu (0.1–0.5 mo A260).

E rua ano nga ahuatanga whaihua: ka iti ake te 0.3 i te wa ka inehia te A260/A280 ki te wai;i te mea ko te ōwehenga i inehia ki te 10 mM EDTA he 0.2 teitei ake i tera i whanganga ki te 1 mM EDTA.

Hua e pā ana:

China Plant Tapeke RNA Isolation Kit Kaihanga me te Kaiwhakarato |Foregene (foreivd.com)

Rangatū wehe RNA Kaihoko me te wheketere |Haina RNA raupapa wehe Kaihanga Kaihanga (foreivd.com)

He raupapa wehe RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)