Ⅰ. Whakanuia te tairongo o te punaha tauhohenga:

1. Wehea te RNA-kounga teitei:

Ko te whakahiato cDNA angitu ka ahu mai i te RNA-kounga teitei.Ko te RNA-kounga teitei me whakarite kia roa ake te roa, karekau he aukati karekau i roto i nga whākōkī tuhi, pēnei i te EDTA me te SDS.Ko te kounga o te RNA ka whakatau i te uara teitei o nga korero raupapa ka taea e koe te tuhi ki te cDNA.Ko te tikanga purenga RNA whanui he tikanga taahiraa mo te whakamahi isoocyanate/acidophenol.Hei aukati i te parahanga o te RNase, ko te RNA kua wehea mai i tetahi tauira whai rawa i roto i te RNase (penei i te pancreas) me penapena te formaldehyde hei whakaora i te RNA kounga teitei, he mea nui ake mo te rokiroki mo te wa roa.Ko te RNA i tangohia mai i te ate kiore i tino whakahekehia i muri i te kotahi wiki o te rokiroki i roto i te wai, i te mea ka mau tonu te RNA i tangohia mai i te kiore i muri i nga tau e toru o te rokiroki i roto i te wai.I tua atu, ko nga tuhinga nui ake i te 4kb he nui ake te aro ki te whai i te whakahekenga RNase atu i nga tuhinga iti.Hei whakanui ake i te pumau o te tauira RNA rokiroki, ka taea te rewa te RNA i roto i te methalmamine o te katote, ka rongoa -70 °C.Ko te Thylide i whakamahia hei tiaki i te RNA me kaua e mau he ahanoa rereke e whakaheke ana i te RNA.Ko te RNA, i ahu mai i te pancreas, ka taea te penapena ki te methalmamine mo te kotahi tau neke atu.Ina reri koe ki te whakamahi i te RNA, ka taea e koe te whakamahi i nga tikanga e whai ake nei hei whakaheke i te RNA: taapirihia te NaCl ki te 0.2m me te 4 nga wa te rōrahi o te waihā, waiho te pāmahana rūma mo te 3-5 meneti, me te 10,000 × g centrifugal mo te 5 meneti.

2. Whakamahia te whakamuri transcriptase kaore he mahi RNaseH (RNaseH-):

He maha nga wa ka taapirihia nga aukati RNase ki te whakamuri i nga tauhohenga whakawhiti hei whakanui ake i te roa me te tukunga o te cDNA synthesis.Ka taapirihia te aukati RNase i roto i te tauhohenga whakahiato o te mekameka tuatahi i te aroaro o nga kaitarai me te whakaheke i nga kaihoko penei i te DTT na te mea ka whakakorehia e te tukanga whakahiato i mua i te cDNA te aukati, na reira ka tuku i nga RNases here e whakaheke ana i te RNA.Ko te aukati RNase Protein anake ka aukati i te whakahekenga o te RNA na te RNase A, B, C, me te kore e aukati i nga RNases i runga i te kiri, na reira me tupato kia kaua e whakauruhia nga RNases mai i nga maihao ahakoa te whakamahi i enei aukati.

Ko te transcriptase whakamuri ka huri i te RNA ki te cDNA.Ko te M-MLV me te AMV he mahi RNaseH endogenous hei taapiri atu ki a raatau ake mahi polymerase.Ka whakataetae te ngohe RNaseH ki te ngohe polymerase mo nga whenu heterozygous i hanga i waenga i nga tauira RNA me nga papa tuatahi o te DNA, i nga whenu toronga cDNA ranei, me te whakaheke i te RNA: nga whenu RNA i roto i nga matatini DNA.Ko nga tauira RNA kua whakahekehia e te mahi RNaseH kaore e taea te whakamahi hei taputapu whai hua mo te whakahiato cDNA, ka whakaiti i te hua me te roa o te whakahiato cDNA.Ko te whakakore, te whakaiti nui ranei i te mahi RNaseH o te whakamuri transcriptase ka tino painga.

SuperScriptⅡ whakamuri transcriptase, MMLV whakamuri transcriptase o RNaseH- me te thermoScript whakamuri transcriptase, AMV o RNaseH- ka nui ake te roanga cDNA i te MMLV me te AMV.Ko te tairongo RT-PCR e pa ana ki te nui o te cDNA kua whakahiatotia.He tairongo ake te ThermoScript i te AMV.Ko te rahi o nga hua RT-PCR he iti noa na te kaha o te whakamuri transcriptase ki te whakahiato cDNA, ina koa ka kati i nga Cdna nui ake.Ka whakatauritea ki te MMLV, SuperScripⅡ i tino piki ake te hua o nga hua RT-PCR roa.Ko te whakawhitinga whakamuri a RNaseH- ka whakanui ake i te pumau o te waiariki, no reira ka taea te tauhohenga ki nga pāmahana teitei ake i te tikanga o te 37-42 ℃.I raro i nga tikanga whakahiato, i whakamahia nga oligo(dT) tuatahi me te 10μCi [alpha-p]dCTP.Ko te katoa o te hanga o te mekameka tuatahi i tatauhia ma te whakamahi i te tikanga rerenga TCA.I wetewetehia te cDNA roa-katoa ma te tango i te tiihi-rahi me te tatau i roto i te reera agarose alkaline.

3. Whakanuia te pāmahana tiaki wera o te tuhi whakamuri:

Ko te teitei ake o te pāmahana pupuri ka awhina ki te whakatuwhera i te hanganga tuarua o te RNA me te whakanui ake i te hua o te tauhohenga.Mo te nuinga o nga tauira RNA, ko te pupuri i te RNA me te tuatahi ki te 65°C me te kore he parepare, he tote ranei, katahi ka whakamatao tere ki runga tio ka whakakore i te nuinga o nga hanganga tuarua, ka taea te here i nga papa tuatahi.Heoi ano, he hanganga tuarua tonu etahi tauira, ahakoa i muri i te whakahekenga waiariki.Ka taea te whakakaha i enei tauira uaua ma te whakamahi i te ThermoScript reverse transcriptase me te whakanoho i te tauhohenga whakamuri transcriptase ki nga pāmahana teitei ake hei whakapai ake i te whakakaha.Ko te teitei ake o te pāmahana pupuri ka piki ake te motuhake, ina koa ka mahia te whakahiatotanga cDNA ma te whakamahi i nga tohu tuatahi-a-ira (GSPS) (tirohia te Upoko 3).Mēnā kei te whakamahi i te GSP, kia rite te uara Tm o te tuatahi ki te pāmahana pupuri e tika ana.Kaua e whakamahi i te oligo(dT) me te matapōkere i runga ake i te 60 ℃.Me pupuri nga papa tuatahi i te 25 ℃ mo te 10 meneti i mua i te piki ki te 60 ℃.I tua atu i te whakamahi i te teitei o te whakamaarama whakamaarama whakamuri, ka taea te whakapai ake ma te whakawhiti tika i te ranunga RNA / tuatahi mai i te 65 ℃ whakamaarama whakamaarama ki te whakamaarama whakamaarama whakamuri me te taapiri i te ranunga tauhohenga 2× kua whakamahana (cDNA thermal initiation synthesis).Ka awhina tenei huarahi ki te aukati i te tauruatanga o te turanga ipoipoi ka puta i te pāmahana iti.Ma te whakamahi i tetahi taputapu PCR ka ngawari te maha o nga huringa pāmahana e hiahiatia ana mo te RT-PCR.

Tth wera whakapumau polymerase mahi hei DNA polymerase i te aroaro o Mg2+ me RNA polymerase i te aroaro o Mn2+.Ka taea e ia te pupuri i te wera ki runga ki te 65 ℃.Heoi, ko te noho mai o Mn2+ i te wa o te PCR ka whakaiti i te pono, ka iti ake te pai o te Tth polymerase mo te whakakaha tino tika, penei i te cDNA cloning.I tua atu, he iti ake te kaha o te Tth ki te whakawhitinga whakamuri, e whakaiti ana i te aro, a, i te mea ka taea e te enzyme kotahi te mahi i te whakawhiti whakamuri me te PCR, kaore e taea te whakamahi i nga tauhohenga whakahaere me te kore tuhinga whakamuri ki te wehewehe i nga hua whakakaha o te cDNA mai i era o te DNA genomic poke.

4. Te taapiri e whakatairanga ana i te tuhi whakamuri:

Ko te taapiri o nga taapiri, tae atu ki te glycerin me te DMSO, ki te tauhohenga whakahiato mekameka tuatahi ka taea te whakaiti i te pumau o te whenu rua o te waikawa karihi me te whakakore i te hanganga tuarua o te RNA.Tae atu ki te 20% glycerin, 10% DMSO ranei ka taea te taapiri me te kore e pa ki nga mahi a SuperScriptⅡ, MMLV ranei.Ka taea hoki e te AMV te aro ki te 20% glycerol me te kore e whakaiti i te mahi.Hei whakanui ake i te tairongo o te RT-PCR i roto i te SuperScriptⅡ whakamuri tauhohenga whakawhiti, 10% te glycerol ka taea te taapiri me te whakamaarama ki te 45 ℃.Mena ka taapirihia te 1/10 o te hua retrotranscription-rection ki te PCR, ko te kukū o te glycerol i roto i te tauhohenga whakakaha he 0.4%, kaore e ranea ki te aukati i te PCR.

5. Tukatuka RNaseH:

Ka taea te whakapai ake ma te rongoa i nga tauhohenga whakahiato cDNA me te RNaseH i mua i te PCR.Mo etahi tauira, ko te whakaaro ko te RNA i roto i te tauhohenga whakahiato cDNA ka aukati i te herenga o nga hua whakakaha, na te mea ka taea e te maimoatanga RNaseH te whakanui ake i te maarama.Ko te tikanga, ka hiahiatia te maimoatanga RNaseH mo te whakanui i te tauira cDNA tino roa, penei i te tuberous scherosisⅡ he iti te kape.Mo tenei tauira uaua, i whakanuia e RNaseH te tohu i hangaia e te cDNA i synthesed e SuperScriptⅡ ranei AMV.Mo te nuinga o nga tauhohenga RT-PCR, he mea whiriwhiri te maimoatanga RNaseH na te mea ko te 95 ℃ te whakamaaramatanga o te PCR denaturation hikoi te whakamaarama i te RNA mai i te RNA: te matatini DNA.

6. Nga tikanga pai ake mo te kimi RNA iti:

He tino wero te RT-PCR ina he iti noa te RNA e waatea ana.Ko te taapiri o te glycogen hei kaikawe i te wa o te wehenga RNA ka awhina ki te whakanui ake i nga hua o nga tauira iti.Ka taea te taapiri i te glycogen RNase-kore i te wa ano ko Trizol.Ko te Glycogen he wai-wairewa, ka noho tonu ki te wahanga wai me te RNA hei awhina i te rerenga o muri mai.Ko te kukū o te glycogen RNase-kore he 250μg/ml mō ngā tauira iti iho i te 50mg o te kiko, 106 pūtau ahurea rānei.

Ko te taapiri o te BSA acetylated ki te huri i nga tauhohenga whakawhiti ma te whakamahi i te SuperScriptⅡ ka taea te whakanui ake i te maarama, a, mo te iti o te RNA, ka whakaheke i te nui o te SuperScriptⅡ me te taapiri i nga waahanga 40 o te RnaseOut nuclease inhibitor ka taea te whakapai ake i te taumata kitenga.Mena ka whakamahia te glycogen i roto i te wehenga RNA, ko te taapiri o te BSA, RNase inhibitors ranei hei whakahuri i nga tauhohenga tuhi ma te whakamahi i te SuperScriptⅡ ka tūtohu tonu.

Ⅱ. Whakanuia te motuhake o te RT-PCR

1. te whakahiato cNDA:

Ka taea te whakamahi i nga tikanga rereke e toru ki te timata i te whenu tuatahi cDNA synthesize, a, ko te motuhake o ia tikanga ka pa ki te nui me te momo cDNA kua whakahiatotia.

Ko te tikanga tuatahi matapōkere te iti rawa o ngā tikanga e toru.Ka whakahiatohia nga papa tuatahi ki nga waahi maha puta noa i te tuhinga hei whakaputa i te cDNA poto, te roa o te waahanga.Ka whakamahia tenei tikanga ki te tiki 5′ raupapa mutunga me te cDNA mai i nga tauira RNA me nga rohe hanganga tuarua, me nga waahi whakamutu ranei e kore e taea e te transcriptase whakamuri te tukurua.Ki te whiwhi i te cDNA roa rawa atu, me whakatau te tauwehenga o nga timatanga ki te RNA i ia tauira RNA me whakatau i nga tikanga.Te kukū tuatahi o primers matapōkere awhe i 50 ki te 250ng ia 20μl pūnaha tauhohenga.Na te mea ko te cDNA i whakahiato mai i te tapeke RNA ma te whakamahi i nga papaamata matapōkere ko te RNA ribosom te nuinga, ko te poly(A)+RNA ka tohua hei tauira.

Ko te timatanga o Oligo(dT) he mea motuhake ake i nga timatanga matapōkere.Ka whakakotahi ki te hiku poly(A) ka kitea i te pito 3′ o te mRNA i te nuinga o nga pūtau eukaryotic.I te mea ko te poly(A)+RNA he 1% ki te 2% o te tapeke RNA, he iti ake te nui me te uaua o te cDNA i te mea ka whakamahia nga matapae tuatahi.Na tona tino motuhake, karekau te oligo(dT) e rapu arotautanga mo te RNA ki te tauwehenga tuatahi me te kowhiringa poly(A)+.E taunaki ana kia whakamahia te 0.5μg oligo(dT) ia 20μl pūnaha tauhohenga.Ko te oligo(dT)12-18 he pai mo te nuinga o te RT-PCR.Ko te Pūnaha ThermoScript RT-PCR e whakarato ana i te oligo(dT)20 na te pai o te pumau o te waiariki, he pai hoki mo te teitei ake o te pāmahana pupuri.

Ko nga tohu tuatahi ira-motuhake (GSP) nga mea tino pai rawa atu mo te hikoi whakamuri whakamuri.Ko te GSP he oligonucleoside antisense ka taea te whakakotahi ki nga raupapa tauranga RNA, kaua ki te whakakii i nga Rna katoa penei i te tuatahi matapōkere, oligo(dT).Ko nga ture e whakamahia ana hei hoahoa i nga papa tuatahi PCR ka pa ano ki te hoahoa o te tauhohenga whakawhiti whakamuri GSP.Ka taea e GSP te raupapa rite ki te tuatahi whakahiatotanga i te mutunga o te mRNA3′, ka taea ranei te GSP te hoahoa ki te whakararo ki te awa ki te reanga whakamuri whakamuri.Mo etahi mea kua whakanuia ake, me hoahoa kia neke atu i te kotahi te tuatahi o te antisense mo te RT-PCR angitu na te mea ko te hanganga tuarua o te RNA whainga ka kore e herea te tuatahi.E whakaarohia ana kia whakamahia te 1pmol antisense GSP i roto i te punaha tauhohenga whakahiato mekameka tuatahi o te 20μl.

2. Whakanuia te pāmahana tiaki wera o te tuhi whakamuri:

Kia pai ai te tino mohio o te GSP, me whakamahi te transcriptase whakamuri me te mau tonu o te waiariki.Ka taea te whakamaarama i te whakamaarama whakamuri whakamuri-wera ki te teitei ake o te mahana hei whakanui ake i te kaha tauhohenga.Hei tauira, ki te whakahiatohia te GSP ki te 55°C, karekau e tino whakamahia te moohiotanga o te GSP mena ka mahia te whakamaoritanga whakamuri ki te 37°C me te kaha iti ma te whakamahi AMV, M-MLV ranei.Heoi, ka taea e SuperScripⅡ me ThermoScript te tauhohe i te 50 ℃ teitei ake ranei, e whakakore ana i nga hua kore e hua ana i te pāmahana iti.Mo te tino motuhake, ka taea te whakawhiti tika te ranunga RNA/paariki mai i te 65 ℃ te pāmahana denaturation ki te whakamaarama whakamuri e pupuri ana me te taapiri o te ranunga tauhohenga 2x kua whakawerahia (te whakamaaramatanga o te whakahiato cDNA).Ka awhina tenei ki te aukati i te takirua turanga i waenga i nga ngota ngota i te pāmahana iti.Ma te whakamahi i te taputapu PCR ka ngawari te maha o nga whakawhitinga pāmahana e hiahiatia ana mo te RT-PCR.

3. Whakaitihia te poke DNA ira tangata:

Ko tetahi raruraru pea ki te RT-PCR ko te RNA ka whakapoke i te DNA genomic.Ko te whakamahi i nga tikanga wehewehe RNA pai ake, penei i te Trizol Reagent, ka whakaiti i te poke DNA genomic i roto i nga whakaritenga RNA.Hei karo i nga hua ka puta mai i te DNA ira tangata, ka taea te rongoa te RNA ki te DnasⅠ tohu whakakaha hei tango i te DNA poke i mua i te whakamuri i te tuhi.I pupurihia nga tauira ki te 65 ℃ i te 2.0mM EDTA mo te 10 meneti hei whakamutu i te nakunaku DNaseⅠ.EDTA chelates konupora katote ki te aukati i te konupora katote RNA hauwai wai e puta i te pāmahana teitei.

Hei wehe i te cDNA kua whakakahahia mai i te hua whakakaha DNA genome, ka taea te hoahoa i nga mea tuatahi e hono motuhake ana me te exon wehea.Ko nga hua PCR i ahu mai i te cDNA ka poto ake i era i ahu mai i te DNA ira tangata pokea.Ka mahia ano he whakamatautau karekau he tuhi whakamuri ki ia tauira RNA hei whakatau mehemea no te DNA ira, cDNA ranei tetahi mahanga.Ko nga hua PCR i riro mai i te kore o te tuhi whakamuri i ahu mai i te genome.

Hua e Pa ana

RT-PCR ngawari^ᵀᴹAhau(Kotahi Hipanga)

-Ko te kete kotahi-taahiraa ka taea te mahi whakamuri me te PCR i roto i te ngongo kotahi.Me taapiri noa i te tauira RNA, nga tohu tuatahi PCR me te RNase-Free ddH₂O.

-Ka taea te tere me te tika te tātari ine ine o te RNA.

-Ka whakamahia e te kete he reagent whakamuri whakamuri o Foregene me te Foregene HotStar Taq DNA Polymerase me te punaha tauhohenga ahurei hei whakapai ake i te kaha o te whakakaha me te motuhake o te tauhohenga.

-Ko te punaha tauhohenga pai ake ka nui ake te maaramatanga o te tauhohenga, he kaha ake te pumau o te waiariki, me te pai ake o te manawanui.

RT Easy II(Me te GDNase) Master Premix Mo te Waa Tuatahi CDNA Synthesis Mo te Wa Tuturu PCR Me te GDNase

-He kaha ki te tango i te gDNA, ka taea te tango i te gDNA i roto i te tauira i roto i te 2 meneti.

- He pai te punaha whakawhiti whakamuri, he 15 meneti noa iho hei whakaoti i te whakahiatotanga o te whenu tuatahi cDNA.

-Tairaira Matatini: ka taea hoki te huri i nga tauira me te GC teitei me te hanganga tuarua matatini me te tino pai.

-Ko te punaha whakamuri whakamuri teitei, ka taea e nga tauira taumata-pg te tiki cDNA kounga teitei.

-Ko te punaha whakamuri whakamuri he nui te waiariki, ko te pāmahana tauhohenga tino pai ko te 42 ℃, a he pai tonu te mahi whakamuri i te 50 ℃.