1. Te maarama tuatahi

I tenei wa, me mohio tatou ki etahi ariā me etahi kupu, kia kore ai e pohehe i mua i o tatou kaumatua, penei:

Q: He aha te rereketanga i waenga i te RT-PCR, qPCR, PCR-wa-Tuturu, me te RT-PCR-waa?

Whakautu: Ko te RT-PCR he PCR whakawhiti whakamuri(whakamuri whakamuri PCR, RT-PCR), he momo rereke e whakamahia ana mo te tauhohenga mekameka polymerase (PCR).I roto i te RT-PCR, ka huri whakamuri te whenu RNA ki te DNA taapiri, ka whakamahia hei tauira mo te whakakaha DNA ma te PCR.
Wā-tūturu-PCR me te qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) he rite tonu te mea, he PCR ine-wa-tuuturu, ko te tikanga ko ia huringa o te PCR he rekoata raraunga tuuturu, na reira ka taea te whakatika i te maha o nga tauira tiimata te tātari tika.

Ahakoa ko te PCR Wa-Tuturu (PCR ine-wa-tu-tuu) me te PCR Whakamuri te whakamaoritanga PCR (whakamuri whakamuri PCR) te ahua kua whakapotohia hei RT-PCR, ko te tikanga o te ao: Ko te RT-PCR te korero mo te whakamuri whakamuri.PCR , Ko te PCR wa-tūturu ka whakapotohia hei qPCR (PCR wa-tūturu ine).

Me te RT-PCR (RT-qPCR), ko te PCR whakamuri whakamuri kua honoa me te hangarau ine ine.: tuatahi tiki cDNA (RT) mai i te RNA whakamuri whakamuri, katahi ka whakamahi PCR Wa-Tuturu mo te tātari ine (qPCR).Ko te nuinga o nga taiwhanga e mahi ana i te RT-qPCR, ara, he rangahau mo te RNA expression down-regulation, no reira ko te qPCR e korerohia ana e nga tangata katoa i roto i te taiwhanga e pa ana ki te RT-qPCR, engari kaua e wareware he maha tonu nga whakamatautau DNA i roto i nga tono haumanu.Te tātari ine, penei i te mate hepatitis B huaketo HBV kitea.

Uiui: Whai muri i te panui i te maha o te PCR ine korakora, he aha te take me whakahaere te kongakonga whakahiato i roto i te awhe o te 80-300bp?

Whakautu: He rereke te roa o ia raupapa ira, he maha nga kb etahi, he rau bp etahi, engari me tono noa te roa o te hua ki te 80-300bp i te wa e hoahoa ana i nga kaupapa tuatahi, he poto rawa, he roa rawa ranei kaore e pai mo te rapu PCR ine ine.He poto rawa te kongakonga hua ki te wehewehe mai i te riima-dimer.He 30-40bp te roa o te riima-iti, a he uaua ki te wehe mena he reima-a-mua, he hua ranei mena he iti iho i te 80bp.Mena he roa rawa te kongakonga hua, neke atu i te 300bp, ka ngawari te arahi ki te iti o te kaha o te whakakaha, a kaore e taea te kite i te nui o te ira.

Hei tauira, ina tatau koe e hia nga tangata kei roto i te akomanga, me tatau noa e hia nga waha.He pera ano ina kitea e koe nga ira, me kite noa koe i tetahi raupapa o te ira hei tohu Ka mahi te raupapa katoa.Mena kei te pirangi koe ki te tatau tangata, me tatau nga waha me nga ihu, nga taringa, me nga mohiti, he ngawari te he.

Hei whakawhānui ake, i roto i te rangahau koiora, he maha nga keehi rangahau mai i tetahi waahi ki tetahi waahi, na te mea he roa rawa te raupapa ira o tetahi momo, kaore e tika, kaore hoki e taea te ine i nga kongakonga katoa, penei i te raupapa 16S huakita, ara ko te whakahaere i te raupapatanga o te huakita He whakamatautau hei whakatau i te maha o tetahi taupori huakita.

Q: He aha te roa tino pai mo te hoahoa tuatahi qPCR?

Whakautu: Ko te tikanga, ko te roa o te tuatahi ko te 20-24bp, he pai ake.Ko te tikanga, me aro tatou ki te uara TM o te tuatahi i te wa e hoahoa ana i te tuatahi, na te mea e pa ana tenei ki te pāmahana annealing tino pai.I muri i te maha o nga whakamatautau, kua whakamatauhia ko te 60°C te uara TM pai ake.Mēnā he iti rawa te pāmahana whakahiato, ka ngawari te arahi ki te whakakaha kore-motuhake.Mena he tiketike rawa te pāmahana whakahiato, ka iti te kaha o te whakakaha, ka timata te tihi o te pihi whakakaha i muri mai, ka whakaroa te uara CT.

P: He pehea te rereke o te tikanga tae ki te tikanga tirotiro?

Whakautu: Tikanga waikanoKo etahi o nga waikano korikori, penei i te SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, me etahi atu, karekau e tuku marama i a ratou ano, engari ka tuku i te korakora i muri i te herenga ki te riu iti o te DNA whenu-rua.Na reira, i te timatanga o te tauhohenga PCR, kaore e taea e te miihini te kite i te tohu rewharewha.Ka tae te tauhohenga ki te waahi whakawhanaunga-whakaroa, ka whakatuwherahia te whenu takirua, ka whakahiatotia he whenu hou i raro i te mahi a te DNA polymerase, ka herea te ngota ngota rekoata ki te awaawa iti dsDNA.Ka piki ake te maha o nga huringa PCR, ka maha ake nga waikano ka honoa ki te DNA paerua-rua, me te whakanui tonu i te tohu rewharewha.Ko te tikanga waikano e whakamahia ana i roto i te rangahau pūtaiao.
PS: Kia tupato i te wa e mahi ana i te whakamatautau, me hono te waikano ki te DNA tangata, kia tupato ki te huri hei tangata korikori.

Tikanga tae (mauī) Tikanga rangahau (matau)
PS: Kia tupato i te wa e mahi ana i te whakamatautau, me hono te waikano ki te DNA tangata, kia tupato ki te huri hei tangata korikori.

SYBR Green Ⅰ herea ki te riu iti o te DNA

Tikanga tirotiroKo te rangahau a Taqman te rangahau hydrolysis e whakamahia nuitia ana.He roopu korikori kei te pito 5′ o te rangahau, ko te nuinga o te waa ko te FAM, a ko te rangahau ano he raupapatanga e hono ana ki te ira e whai ana.He roopu tinei kare i te pito 3′.E ai ki te kaupapa o te whakawhiti hiko o te waatea (te whakawhiti hiko o te kairongo, i te wa e piri ana te kairongo o te spectrale. Ahakoa kua ngoikore te autofloresce.No reira, i te timatanga o te tauhohenga PCR, ina watea ana te tirotiro me te mau tonu i roto i te punaha, karekau te roopu kaikawe korero e whakaputa i te rewharewha.Ka herea ana, ka herea te tuatahi me te tirotiro ki te tauira.I te wa o te toronga, ka whakahiatotia e te polymerase nga mekameka hou.Ko te DNA polymerase he 5′-3′ mahi exonuclease.Ka tae atu ki te rangahau, ka whakamaarama e te polymerase DNA te rangahau mai i te tauira, ka wehea te roopu rekoata kairipoata mai i te roopu kareoro tineia, ka tuku i te tohu kareoro.I te mea he hononga kotahi ki te kotahi i waenga i te rangahau me te tauira, he pai ake te tikanga tirotiro i te tikanga tae i runga i te tika me te tairongo o te whakamatautau.Ko te tikanga tirotiro ka whakamahia i roto i te tātaritanga.

Q: He aha te inenga tino?He aha te Relative Quantification?

Whakautu: Ko te inenga tuturu e pa ana ki te tataunga o te nama kape tuatahi o te tauira ka whakamatauria e te qPCR, penei i te maha o nga huaketo HBV kei roto i te 1ml toto.Ko te hua ka puta mai i te inenga whanaunga ko te whakarereketanga o te nui o te ira i whaaia i roto i tetahi tauira motuhake e pa ana ki tetahi atu tauira tohutoro, a ko te whakaputanga o te ira he mea whakarunga, he whakaheke ranei.

P: Ka pa te nui o te tangohanga RNA, te pai o te tuhi whakamuri, me te kaha whakakaha ki nga hua whakamatautau?
P: Ka pa ki nga hua whakamätautau mo te rokiroki tauira, nga reagents tangohanga, nga reagents tuhi whakamuri, me nga taonga tuku marama?
P: He aha te tikanga ka taea te whakatika i nga raraunga whakamatautau?

Mo enei take, ka whakaahuahia e matou i roto i nga waahanga matatau me nga waahanga o raro.
2. Te matauranga matatau

Mo te PCR ine ine-a-waa, me mohio tatou he mano nga pepa rangahauiao e whakaputahia ana ia tau, i roto i enei ko te hangarau PCR ine kareoro ehara i te mea iti.

Mena karekau he paerewa noa hei ine i te whakamatautau PCR ine korakora, ka rereke pea nga hua.Mo te ira kotahi o te momo momo, he rite tonu te tikanga tukatuka, ka rereke ano nga hua kitenga, a he uaua ki te hunga tomuri ki te whakahoki ano i nga hua ano.Koe Kaore tetahi e mohio ko tehea te tika me te he.

Ko te tikanga tenei he hangarau tinihanga te PCR ine karemarama he hangarau kore pono ranei?Kao, na te mea he tairongo ake, he tika ake hoki te PCR ine karemarama, a, na te iti o te mahi he ka puta nga hua rereke.Ko te mate iti he mano maero te tawhiti.Ko te kaituhi o te tuhinga ka tukinohia e nga kai-arotake.I te wa ano, he uaua ano nga kaiarotake o te hautaka ki te whiriwhiri mai i nga momo hua whakamatautau.

Katoa, e tohu ana ki te kore o te whakaaro i roto i nga whakamatautau PCR-waahi.I tenei mutunga, i timata nga kaiputaiao matua o te umanga ki te hanga paerewa,e hiahia ana ki nga kaikohae ki te whakarato i etahi taipitopito whakamatautau me te tukatuka raraunga e tika ana (tae atu ki nga raraunga e tika ana) i roto i te tuhinga ki te whakatutuki i enei paerewa.

Ka taea e nga kaiarotake te whakatau i te kounga o te whakamatautau ma te panui i enei korero;Ka taea hoki e nga kaipanui a muri ake te whakamahi i tenei ki te whakahoki ano i te whakamatautau, ki te whakapai ake ranei i te whakamatautau.Na ko nga hua whakamatautau ka puta i tenei huarahi ka ki tonu i nga korero, te kounga teitei, me te whakamahi.

MIBBI (Te iti rawa o nga korero mo nga rangahau koiora me te rongoa koiora -http://www.mibbi.org) i puta mai.Ko te MIBBI he kaupapa e whakarato ana i nga paerewa mo nga whakamatautau.Ka whakaputaina i roto i te taiao.Ko tenei kaupapa e whai ana ki nga momo whakamatautau koiora, tae atu ki te koiora pūtau, Microarray, qPCR ka matapakihia e tatou inaianei, me etahi atu, me te whakarato mo ia momo whakamatautau ina tuku tuhinga.Me tuku aua korero i nga wa katoa.

I roto i te kaupapa MIBBI, e rua nga tuhinga e pa ana ki te PCR quantitative fluorescent, ara:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – he reo hanganga me te aratohu korero mo nga raraunga PCR ine-wa-tui;
·MIQE (Te Moohio Moonga mo te Whakaputa i nga Whakamatau PCR Waa Tuturu Ine) – nga korero iti mo te whakaputa tuhinga mo nga whakamatautau PCR ine-wa-tui.
Tuatahi, me korero tatou mo te RDML, te tohu kupu.

Mena kaore he whakamaramatanga paerewa mo nga mea katoa, kaore e taea te haere tonu i te korerorero, na te mea he mea nui te whakamaramatanga o nga kupu i roto i te whakamatautau.
Kei roto i nga kupu e whakamahia ana i roto i te whakamatautau PCR ine korakora e whai ake nei.Kua mahia e QIAGEN te whakarapopototanga pai mo tatou.Ko nga mea e whai ake nei he maroke katoataonga .

Te ānau whakakaha
Ko te kurupae whakakaha e pa ana ki te pihi i mahia i te wa o te mahi PCR, me te tau huringa ko te abscissa me te kaha o te rewharewha i te wa o te tauhohenga hei ordinate.

Me whai i nga ahuatanga e whai ake nei i te pihi whakakaha pai: he papatahi, he iti iho ranei te rarangi turanga, kaore he ahua o te pikinga ake;he maamaa te tohu korikori o te pihinga, a, ko te pikinga o te wahanga taupūtanga he rite ki te kaha o te whakakaha.Ko te nui ake o te paheketanga, ka nui ake te kaha o te whakakaha;te ānau whakakaha whānui He pai te whakarara, e tohu ana he rite te kaha o te whakakaha o ia ngongo;ka kitea te wahanga taupū o te ānau whakakaha o nga tauira kukū iti.

Raina turanga (Raina turanga)
Ko te turanga ko te taumata haruru o te huringa moata, i te nuinga o te waa ka inehia i waenga i te huringa 3 me te 15th, na te mea ko te pikinga o te uara fluorescence na te hua whakakaha e kore e kitea i tenei waa.Ko te maha o nga huringa e whakamahia ana ki te tatau i te rarangi turanga ka taea te rereke, me whakaiti pea mena ka whakamahia nga rahinga tauira nui, mena he tiketike te taumata whakahuatanga o te ira i whäia.

Ko te whakarite i te rarangi turanga me tiro nga raraunga rewharewha mai i te ananga whakakaha raina.Kua whakaritea te rarangi turanga kia timata ai te tipu o te pihi whakakaha ki te tau huringa nui ake i te tau o runga huringa turanga.Me whakarite takitahi nga turanga mo ia raupapa whaainga.Ko nga uara rewharewha toharite i kitea i nga huringa o mua me tango mai i nga uara orooro i whiwhi i roto i nga hua whakakaha.Ko nga putanga hou o nga momo rorohiko PCR Wā-Tuturu ka taea te arotautanga aunoa o nga tautuhinga turanga mo nga tauira takitahi.

I roto i nga huringa tuatahi o te tauhohenga whakakaha PCR, karekau e rerekee te tohu rewharewha.Ko te whakatata ki te raina tika e kiia ana ko te rarangi turanga, engari ki te ata titiro ki nga huringa tuatahi, ka kite tatou kei roto i te rarangi turanga te mea kei te pikitia kei raro nei.

He Papamuri He korero mo te papamuri
ko te uara rewharewha kore-motuhake i te tauhohenga.Hei tauira: te koretake o te tineia o te fluorescence;he maha ranei o nga tauira DNA paerua-rua na te whakamahinga o SYBR Green.Ko nga waahanga papamuri o te tohu ka tangohia ma te pangarau e te raupaparorohiko rorohiko PCR-Wa-Tuturu algorithm.

Tohu kairīpoata
Ko te tohu kairīpoata e pā ana ki te tohu korakora i hangaia e SYBR Green, kua tapaina ranei he rangahau raupapa-motuhake i roto i te PCR Wā-Tuturu.

Waitohu Pūrongo Pūnoa (RN)
Ko te RN e tohu ana ki te kaha o te waikano kairipoata kua wehea ki te kaha o te waikano tohutoro hāngū i ine i ia huringa.

Waikano Tohutoro Hangū
I etahi PCR Wā-tūturu,ka whakamahia te waikano Korekore ROX hei tohutoro a-roto ki te whakarite i te tohu korakora.Ka whakatika i nga rereketanga na te kore o te paipa paipa, te tuunga pai, me te rerekee o te korikori i runga i te puna pai.

Ko te paepae rewharewha (paepae)
i whakatikahia ki runga ake i te uara papamuri me te mea nui ki raro i te uara paparahi o te pihi whakakaha.Me takoto ki te rohe raina o te pihi whakakaha, e tohu ana i te awhe rangitaki-raina o te kitenga PCR.Me whakatakoto nga paepae ki te tirohanga anau-whakanui kia ngawari te tautuhi i te wahanga rangitaki-raina o te PCR.Mēnā he maha ngā ira whainga i roto i te PCR Wā-tūturu, me whakarite te paepae mo ia taumata.Ko te tikanga, ka whakamahia te tohu rewharewha o nga huringa tuatahi 15 o te tauhohenga PCR hei tohu papamuri rewharewha, a, ko te paepae koorero he 10 nga wa i te inenga paerewa o te tohu oro o nga huringa tuatahi o te 3 ki te 15 o te PCR, a, kua whakaritea te paepae rewharewha ki te wahanga taupū o te PCR amplification.I te nuinga o te waa, kei ia taputapu tona paepae fluorescence i mua i te whakamahinga.

Paepae Porohita (CT) ira Whakawhiti ranei (CP)
Ko te huringa e whiti ai te ānau whakakaha i te paepae (arā, ko te pūwāhi e tino piki ake ai te kitenga o te rangi).Ko te CT he hautanga ka taea te tatau te nui o te tauira timata.Ko te uara CT e tohu ana i te maha o nga huringa ka kitea i te wa e tae ai te tohu rewharewha o ia ngongo tauhohenga PCR ki te paepae kua whakaritea.He hononga raina i waenga i te uara CT o ia tauira me te taukohiko o te tau kape tuatahi o te tauira, teteitei ake te tau kape tuatahi, ka iti ake te uara CT, me te rereke.Ka taea te hanga i te anau paerewa ma te whakamahi i te paerewa me te tau kape tuatahi e mohiotia ana, ko te abscissa e tohu ana i te uara CT, me te ordinate e tohu ana i te taurua o te tau kape tuatahi.Na reira, i te mea ka whiwhi te uara CT o te tauira e kore e mohiotia, ka taea te tatau i te tau kape tuatahi o te tauira mai i te pihi paerewa.

ΔCT uara
Ko te uara ΔCT e whakaahua anate rerekētanga i waenga i te ira whainga me te uara CT ira tohutoro mutunga, penei i te ira tiaki whare, ka whakamahia hei whakarite i te nui o te tauira i whakamahia:
⇒ΔCT = CT (ira ira) – CT (ira tohutoro endogenous)

ΔΔCT Uara
Ko te uara ΔΔCT e whakaatu ana i te rereketanga i waenga i te uara ΔΔCT toharite o te tauira o te paanga (hei tauira, nga pūtau whakaihiihi) me te uara ΔΔCT toharite o te tauira tohutoro (hei tauira, nga pūtau kore whakaihiihi).Ko te tauira tohutoro ka kiia ko te tauira whakatikatika me era atu tauira katoa ka whakatauritehia ki tenei mo te inenga whanaunga:
⇒ΔΔCT = toharite ΔCT (tauira o te hiahia) – toharite ΔCT (tauira tohutoro)

Ira tohutoro endogenous (ira tohutoro endogenous)
Ko nga taumata korero o nga ira tohutoro endogenous, penei i nga ira tiaki whare (whare tiaki ira), kaore e rereke i waenga i nga tauira.Ko te whakatairite i nga uara CT o te ira tohutoro ki te ira whaanui ka taea te whakataurite i te taumata whakapuaki o te ira whainga ki te nui o te RNA whakauru, cDNA ranei (tirohia te waahanga mo nga uara ΔCT kei runga ake nei).

Ira tohutoro roto tika moka taea te whakahekenga RNA, te noho mai ranei o nga aukati enzyme i roto i nga tauira RNA, tae atu ki nga rereketanga o te ihirangi RNA, te pai o te tuhi whakamuri, te whakaora waikawa karihi, me te whakahaere tauira.Hei whiriwhiri i te (ng) ira tohutoro tino pai, i whakarereketia e matou te algorithm kia taea ai te kowhiri i te tohutoro tino pai ka whakawhirinaki ki te tautuhinga whakamatautau.

Mana whakahaere o roto
He raupapa mana e whakanuia ana i roto i te tauhohenga rite ki te raupapa whainga, ka tirotirohia ki tetahi rangahau rereke (ara, te mahi PCR taarua).He maha nga wa ka whakamahia nga mana o roto ki te whakakore i nga whakahiatotanga rahua, penei i te wa kaore i kitea te raupapa whaainga.
Tauira Whakatau
He tauira tohutoro (hei tauira, te RNA kua purea mai i te raina pūtau, te kiko ranei) ka whakamahia i roto i te ine inenga hei whakatairite i era atu tauira katoa hei whakatau i te taumata whakahuatanga o te ira.Ko te tauira whakatikatika ka taea he tauira, engari ko te tikanga he mana (hei tauira, he tauira kare i mahia, he tauira mai i te wa kore o te whakamatautau).

Nga mana pai
whakamahi tauhohenga mana mete nui o te tauira e mohiotia ana.Ka whakamahia nga mana pai ki te tirotiro kei te pai te mahi o te huinga tuatahi, te huinga rangahau tuatahi, me te whakarite tika te tauhohenga.

Kore Mana Tauira (NTC)
He tauhohenga whakahaere kei roto nga waahanga katoa e tika ana mo te tauhohenga whakakaha engari ko te tauira, ka whakakapihia ki te wai.Ma te whakamahi i te NTC ka kitea te poke i puta mai i te reagent contamination, i te DNA kee ranei, na reira ka whakarite i te pono me te pono o nga raraunga kitenga.Ko te whakanui i te mana NTC e tohu ana i te poke.

Kore he mana RT (NRT)
Kei roto pea i te tukanga tangohanga RNA te toenga o te DNA genomic, he tino kino, ko te tangata nana i pa te kounga o nga raraunga me te hoariri o te qPCR, na i te wa e hoahoa ana i nga whakamatautau, me hoahoa ki te whakanui i te kitenga RNA anake.E rua nga huarahi, ko tetahi ko te hoahoa tuatahi ki nga whakaurunga, ko tetahi ko te tango katoa i te DNA, ko tehea te mea pai ake, ka korerohia i muri mai.Ko te mana NTR he whakaata makutu hei kite i te parahanga DNA.Mena he whakakaha, ko te tikanga he parahanga.

Paerewa
Ko nga paerewa he tauira o te kukū e mohiotia ana, te tau kape ranei e whakamahia ana hei hanga i te anau paerewa.Hei whakapumau i te pumau o te paerewa, ko te wahanga ira i te nuinga o te waa ka kohia ki te plasmid ka whakamahia hei paerewa.

Te ānau paerewa
Ko te tikanga ka diluted ki te iti rawa 5 rōnaki kukū ki te hua paerewa i runga i te ōwehenga rearua, a ka unu nga tohu 5 i roto i te taunga o te uara CT me te tau kape, a ka hono nga tohu ki te hanga i te raina ki te whakaputa i te ānau paerewa.Mo ia pihinga paerewa, me tirohia tona mana.Ka taka te uara titaha ki waenga i te –3.3 me te –3.8, ka mahia ia kukū kia toru.Ko nga tohu e tino rerekee ana i etahi atu tohu me whakakore.Ko te uara CT o te tauira ka whakamatauria ka kawea mai ki roto i te pihi paerewa, a ka taea te tatau te taumata whakapuaki o te tauira ka whakamatauria.

Ko te uara CT o te tauira ka whakamatauria ka kawea ki roto i te pihi paerewa, ka taea te tatau i te nama kape tuatahi o te tauira ka whakamatauria.

Te kaha me te titahatanga
Ko te pikinga o te pihi paerewa e tohu ana i te kaha o te PCR-wa-tuuturu.
·Ko te hekenga o te -3.322 e tohu ana ko te pai o te whakakaha PCR he 1, he 100% pai ranei, a ka ruarua te nui o te hua PCR i ia huringa.
·Ko te hekenga iti iho i te –3.322 (hei tauira, –3.8) e tohu ana i te pai o te PCR
·Ko te hekenga nui ake i te –3.322 (hei tauira, –3.0) e tohu ana he nui ake te pai o te PCR i te 100%, he mea miharo, me pehea e taea ai e tetahi huringa PCR te whakaputa neke atu i te rua o te hua whakakaha?Ka puta tenei ahuatanga i roto i te waahanga kore-raina o te tauhohenga PCR, ara, he nui te whakanuinga kore-motuhake.

ānau rewa
Ka oti te whakakaha o te qPCR, ka whakamahana te hua PCR.I te pikinga o te pāmahana, ka rewa te hua whakahiato pae-rua, ka heke iho te kaha o te rewharewha.Ka tae ki tetahi pāmahana (Tm), ka rewa te maha o nga hua.Ka tino heke te korikori.He rereke nga uara Tm o nga hua PCR rereke me nga pāmahana whakarewa rereke, kia kitea ai te motuhake o te PCR.

Anau rewa (anau pahekeheke)
I ahu mai te kurupae rewa ki te hanga i te mapi tihi, ka kaha ake te whakaatu i te ahuatanga o nga kongakonga hua PCR.I te mea ko te pāmahana rewa ko te uara Tm o te wahanga DNA, ka taea te whakatau etahi tawhā e pa ana ki te uara Tm o te kongakonga DNA, penei i te rahi o te kongakonga, te ihirangi GC, me era atu.ko te roa o te hua whakakaha kei roto i te awhe o te 80-300bp, no reira me noho te pāmahana rewa i waenga i te 80°C me te 90°C.

Te whakamaoritanga o te pihi rewa: Mena ka puta te tihi matua anake i waenga i te 80°C-90°C, ko te tikanga he tino tika te PCR ine rewharewha;ki te puta te tihi matua i waenga i te 80°C-90°C ka puta etahi momo tihi i raro iho i te 80°C, ka whakaarohia te dimer tuatahi.Ka taea e koe te ngana ki te whakanui ake i te pāmahana whakaene ki te whakaoti;ki te puta te tihi matua i waenga i te 80°C-90°C, ka puta ano te tihi rereke ka piki ake te pāmahana, ka whakaarohia he poke te DNA, me tango te DNA i te wa tuatahi o te whakamatautau.

Ko te tikanga, tera ano etahi ahuatanga rerekee, ka pakaru takitahi ki raro.
3. Te matauranga matatau

Hei mahi qPCR, me kii ahau MIQE,Nga korero itimo te Whakaputa oInePCR Wā-tūturuNga Whakamatau—te iti rawa o nga korero mo te whakaputa tuhinga mo te PCR ine-waanga whakamatautau.Hei whakangawari ake i te maaramatanga o te katoa, ka whakangawarihia nga kaupapa matua.

Ka taea e koe te rapu i te tuhinga taketake o MIQE i runga i te Ipurangi, a ko te mea nui ko te whakatakoto i terarangi arowhai raraunga e tika ana kia tukuna ina whakaputa tuhinga .

Ka taea e nga kaiarotake te whakatau i te kounga o te whakamatautau ma te panui i enei korero;Ka taea hoki e nga kaipanui a muri ake nei te whakamahi i tenei ki te whakahou, ki te whakapai ake ranei i te whakamatautau.
He mea tika kia mohio kei roto i tenei rarangi, ko te hiranga o ia rarangi ka tohua ki te E, D ranei.He aha te tikanga?E: nga korero tino nui (me tuku);D: nga korero e hiahiatia ana (whakaratohia nga mea e taea ana).

MIQE (1)—Hoahoa Whakamatau
He maha nga kaipahua kua oti ta ratou whakamarumaru i muri i te mutunga o a raatau tohu paetahi karekau e mohio ki te hoahoa i tetahi whakamatautau motuhake, ki te whakatuwhera i a raatau pukamahi me te mahi i ta te kaiako e kii ana kia mahia.Ko te mutunga mai, karekau i tino kaha te hoahoa whakamatautau, a, i kii te tari etita o te moheni e hiahia ana ratou ki te hanga i tenei pikitia me tera pikitia, na reira i mahi pohehe.Koinei te ahua o te hanga o nga scumbags!

Ka tata ki te kainga, ko te kaupapa tuatahi o te whakamatautau ko te whakataute pakari o te arorau whakamatautau.Ko te mea tino nui ko te hoahoa whakamatautau, ko te mea nui mo te hoahoa whakamatautau me pehea te whakatakoto i te tauira whainga, te tauira tohutoro (mana), me te maha o nga tukurua, kia taea ai te tohutoro, te whakataurite, me te whakatenatena i nga raraunga whakamatautau.

Ko te tauira whaingae tohu ana ki te tauira e kii ana kia kitea e tatou te ira e whai ana i muri i tetahi maimoatanga.Ko te tauira tohutoroKo te tauira kaore he maimoatanga, e kiia ana he momo mohoao i roto i te koiora.

Ko nga tauira whakamatautauhe mea tino nui.Ko te tikanga, me neke ake i te toru te maha o nga kape whakapati.Me wehewehe he aha te tukurua koiora me te tukurua hangarau.

Koiora Replika: He rite ano te whakamatautau i mahia ki nga momo rauemi (wa, tipu, puranga, pereti tauhohenga).

Te tāruarua koiora
Me whai tauira te maimoatanga pesticide o te pepa.Kei te pirangi matou ki te rehu pesticides ki runga i nga tipu e toru o ABC, katahi ko nga tipu e toru o ABC e toru nga tauira koiora, a he rite tonu te whakamatautau i mahia me nga momo rauemi rereke.Engari hei whakamatautau, ka tino hiahiatia he mana whakahaere, kia taea e tatou te rehu i tetahi o nga peka o te tipu A ki te hanga i tetahi roopu whakamatautau o te tipu A, kaua hoki e rehu i etahi atu peka o te tipu A ki te hanga roopu whakahaere.Me pena ano mo B me C.

Hangarau Hangarau (Tuhinga Hangarau): He whakamatautau tukurua i hangaia hei karo i nga hapa i puta mai i te mahi, he kohao taarua kei roto i te papanga kotahi.Ko nga maimoatanga me nga mana whakahaere me whai tauira taapiri (te iti rawa kia toru) o te ira whainga me te ira tohutoro o roto.

Hangarau tukurua
Me whai tauira ano te pepa kua rongoatia ki te pesticides.Mo te roopu whakamatautau o te tipu A, i hanga e matou etahi kohao PCR e toru o te 1, 2, me te 3 mo tana ira whainga me te ira tohutoro o roto, kia taea ai te tango i te toharite i muri i te kitenga.Mo te whakahaere i te tipu A ka peratia ano nga roopu.He rite ano te mahi mo nga tipu B me C.He tukurua hangarau tenei.

E tano ia tapao eko te mea ka uru ki roto i nga tatauranga ko te tukurua koiora, ko te tukurua hangarau he whakamatautau mena he ahuatanga matapōkere kei roto i te tukanga whakamatautau, kia pono ai nga hua whakamatautau, ara, kia kore ai e hapa ma te tango i to raatau toharite penei i ta tatou e kii nei.

Mana kino—NTC me NRT
NTC (Mana Tātauira Kore), he mana karekau he tauira, ka whakamahia hei manatoko mena kua poke te rauemi whakamatautau.Ko te tikanga, ka whakamahia te wai hei tauira.Mēnā he tauhohenga pūoro, e tohu ana kua pā te poke o te waikawa karihi ki roto i te taiwhanga.

Ko enei parahanga ka puta mai: te wai poke, nga reagents kore e whai mana kei roto i te DNA mutunga, te parahanga tuatahi, te parahanga taputapu taiwhanga, te parahanga aerosol, me era atu, me whakamahi i nga miihini RNase me nga aukati RNase.Ko te parahanga aerosol te tino uaua ki te kimi.Whakaarohia he rite to taiwhanga ki te kohu, me nga momo waikawa karihi e whakatarewa ana i te rangi.

NRT (Kore-Whakamuri Transcriptase), ko te mana kaore he whakawhitinga whakamuri, ko te RNA kore-whakamuri kua tuhia hei mana kino, ko te mana o te toenga o te gDNA.

I te wa e mahi ana i te whakaaturanga ira, ka kitea te nui o te RNA ma te kite i te nui o te cDNA i muri i te whakawhitinga whakamuri.Mena he toenga gDNA i te wa e purea ana te RNA, ka puta he hapa i nga hua whakamatautau, na te mea ko nga hua tuturu ko te gDNA me te cDNA.I te taumata whakahiato, ehara i te cDNA anake, me tino tangohia te gDNA i te wa tangohanga RNA.

MIQE (2)—tauira korero
Ko nga korero e kiia nei ko nga tauira korero ko te tikanga ka whakaputahia e matou he tuhinga mo te qPCR, me whakamarama maatau nga korero tauira, he waahanga tino nui o te tuhinga.Waihoki, i te wa e tukatuka ana tatou i nga tauira, me whakahaere ano e tatou a tatou ake mahi hei whakarite i te mana o nga tauira.

Ko te whakaahuatanga o te tauira he hua noa iho, me aro nui ki nga taonga i tangohia i te wa katoa o te whakamatautau.

Te kowhiringa o nga rawa whakamatautau
Tauira toto – whiriwhiri toto hou, kaua e neke ake i te 4 haora.Tauira pūtau – kōwhiria ki te kohikohi pūtau hou i roto i te wā o te tipu kaha.Tipa Kararehe—Kōwhiritia he kiko hou, e tipu kaha ana.Tiu Tiu - Kōwhiria he kiko hou, he kiko taitamariki.

Kua kite pea koe he kupu matua kei roto i enei rerenga korero: hou .
Mo nga tauira i runga ake nei, ko te kete pai rawa atu, te utu, me te pumau i runga i te maakete ko te kete a Foregene, ka tere me te ngawari te tango i o raatau DNA me te RNA.

Toto DNA Mini Kit

Pūtau Tapeke RNA Wehewehenga Kete

Kararehe Tapeke RNA Isolation Kit

Tipu Tapeke RNA Wehewehenga Kete

Tipu Tapeke RNA Isolation Kit Plus

Te Kete Motuhake ADN Whakatipu

Te rokiroki o nga rauemi whakamatautau
Ko te tikanga, kaore matou e kii ki te penapena tauira, mena ka whakaae nga tikanga.Heoi, he maha nga hoa kaore e taea te whakahaere i nga whakamatautau i muri tonu mai i te whakatauira, me kawe etahi taika hauota wai ki te mara hei whakatauira.

Mo tenei momo hoa pukumahi, ka taea e au te kii kaore koe i te marama ki nga taonga reagent.Inaianei he maha nga kamupene reagent consuming e whakaputa reagents hei penapena tauira RNA ki te pāmahana rūma, ka taea e koe te whiriwhiri ki te whakamahi.Ko te tikanga rokiroki tikanga he rokiroki hauota wai, ma te whakamahi i te tank hauota wai iti e ngawari ana te kawe.Whai muri i te whakahokinga mai o te tauira ki te taiwhanga, rongoa ki roto i te pouaka pouaka -80°C.

Mo nga whakamatautau e pa ana ki te RNA, me whai te kaupapa ono kupu:iti te pāmahana, karekau he whākōkī,atere .

Ko te kaupapa o te iti o te pāmahana he ngawari ki te mohio;kahore he enzymes, kei nga waahi katoa te RNase o te ao e noho nei tatou (mehemea kua mate koe e te HIV), na me pehea te karo i te RNase i te wa e mahi ana nga whakamatautau he kaupapa tino nui;tere,Kaore he Kung Fu i te ao e kore e pakaru, ko te tere anake e kore e pakaru.

Na reira, i roto i te tikanga, te poto te wa tangohanga, te pai te kete.He ahaForegeneKo te kete e whakanui ana i te tere, na te mea e tino mohio ana ratou.

PS: Ko etahi o nga kotiro ka tino tupato ki te whakamatau, engari kaore i te pai ki te slam dunk i muri i nga tau maha o te mahi.Te mana‘o ra ratou e mea tano ore te Atua, e amuamu ratou no vetahi ê, e e imi ratou i te ora.Ko te mea pono, kaore ia i mohio.Karekau i tino tiakina e ia te RNA, a, he kaikawe te kaitakaro slam dunk.I a ia e mahi ana i te whakamatautau, i whakaaro ia ka oti ia ia te slam dunk e toru nga wa, e rima nga wa me nga wehenga e rua, engari he pai tana mahi.

Tuhipoka: He puhoi, he nui ake te tupono o te whakaekenga a RNase.Me pehea te whakangungu ia koe kia tere?Karekau he huarahi, me mahi noa ake.

Mo nga whakamatautau rereke me nga tauira rereke, he mea tika ki te panui atu i nga tuhinga me te whiriwhiri i tetahi tikanga tika mo te tukatuka.Mo te tauira kohinga me te tukanga rokiroki, me tuhi te MIQE ki roto i te pepa, kia taea ai e nga kaiarotake te arotake i te pono o te pepa, me te watea hoki mo nga taiohi ohorere ki te whakahoki ano i to whakamatautau.

Ahakoa he uaua nga whakamatautau koiora, he taumata teitei.Ki te kore koe e tupato, ka taea e koe te huri i te ao.Hei tauira, ko te hanga i te SARS ki roto i te raru koiora, ki te hanga raihi raihi hei whakaora i te 1.3 piriona tangata.Ko te pikitia kei raro nei he whakamatautau matū, me mohio koe ki to whakahīhī ki o rangahau mā te titiro noa ki tana ahua tio.Warewaretia, kaua e pango ia.

MIQE (3) – tangohanga waikawa nucleic.
He huihuinga nui te tangohanga waikawa nucleic, ka timata nga whakamatautau koiora ngota katoa ki te tangohanga waikawa karihi.Tuatahi, me kape nga korero a MIQE mo te tangohanga waikawa karihi.

Ma te titiro ki tenei puka, kaore e taea e koe te noho ki runga.He dogma te ahua.Hei tauira teitei, me patai koe he aha.Ko te mea nui o tenei ripanga ko: Whaiate ma, te tapatahi, te rite, me te nui o te tangohanga o te RNA .

Ko te waahanga tuatahi o teKo te tukanga, te taputapu ranei ko te taahiraa tangohanga waikawa karihi.Mena kei te whakamahi koe i te tango waikawa karihi aunoa ki te tango (maamaa, whakapaa mai ki ahau mo te hoko), me tohu koe i te ingoa tauira o te taputapu.

Te ingoa o te kete me

he aha te kete i whakamahia mo nga taipitopito huringa, he aha nga reagents motuhake i tapirihia, he aha nga mahi motuhake i mahia me whakamarama kia marama ai etahi atu i to whakamatautau.

Ko etahi ka taapiri i etahi reagents motuhake i te wa e tango ana i nga tauira motuhake, me te whakaaro koinei ta ratou patu huna kaore e korero ki etahi atu.I te wa e huna ana, ka ngaro hoki te whai waahi ki te whiti i to tuhinga.Kaua e mohio, me noho pono koe i te whenua tawhito a Zhang i roto i te rangahau putaiao, ki te hiahia koe ki te mohio, ka poauau koe e te tuhinga.

me mahara ki te nama hua o te keteina ota koe i te kete me te tuhi i te tuhinga.E rua nga tau kei runga i te kete: Cat—tau putumōhio (tau hua, tau tuhinga), Rota—tau rota hua ( I whakamahia hei tohu ko wai te puranga i puta mai ai te hua).

I tua atu, ka whakamahia te nama CAS i te wa e tono ana i nga reagents biochemical, a ka whakanuia e ahau ngatahi.Ko te nama CAS te nama i hoatu e te American Chemical Society ki ia raau matū hou.Ko te tikanga, e toru nga tau ka honoa e te pene.Te nama CAS a Rushui: 7732-18-5.He maha nga ingoa o nga matū, engari he ahurei te nama CAS.Ina tono rongoa, ka taea e koe te tirotiro i tana nama CAS i te tuatahi.

Kia tata atu ki te kainga, he aha te take me tino whakamaramatia enei mea?Ko te tikanga, he tirotiro ano i te kounga o te tangohanga RNA.Ma te whakamahi taputapu me nga kete ka pai ake te tangohanga RNA.Ko te rahinga tangohanga o nga taiwhanga noa kaore i te rahi, ka taea te tiki mai me nga kete.

Nga korero mo te maimoatanga DNase, RNase ranei
Ko te take nui o te PCR ine kareoro ko te aukati i te poke DNA, kaua hoki e whakamatau mena he poke.No reira, he mea nui ki te whakaatu i te tukanga i whakamahia e koe ki te tukatuka i te DNA, hei whakaatu kua tangohia katoatia te DNA i roto i te tukanga whakamatautau.e tohuhia ana e te hoahoa hoahoa.

Te hoahoa hoahoa o te RNA me te DNA
I te nuinga, ko te tikanga mo te tango i te DNA ko te rongoa i te RNA me te DNase i muri i te tangohanga.Heoi, he tikanga tawhito enei.I taea e nga kete tangohanga RNA arumoni te tango i te DNA i te wa o te tangohanga me te kore e taapiri i te DNase.Hei tauira, he raupapa kete mai i Foregene.

Tuhipoka: Ko te tango i te DNA i te wa o te tangohanga RNA he hoari mata-rua tino kino, ka roa te wa mahi o te tangohanga RNA me te whakanui ake i te kino o te RNA.Ko te tikanga, he hokohoko i waenga i te tukunga RNA me te ma.

I tua atu, he iti rawa te nui o te DNase i tapirihia ki te kohinga adsorption-silica-based, me te whakamahi i te DNase-kounga teitei hei whakatutuki i te painga.Ko te DNase kaore i arotauhia kaore e taea te keri tere me te tino.He whakamatautau tenei mo te taumata hangarau o te kaihokohoko.Ko te tikanga, he maha atu nga kaihokohoko rereke e whakamanamana ana ka taea te tango i te DNA me te kore DNase.Ka taea te kii ko te tangata e whakamanamana ana ka taea te whakakore rawa i te DNA me te kore DNase he hooligan.Ko te DNA he anga taumau-rua, e kore e taea te muru ma te korero me te katakata.

Aromatawai poke
tikanga aromatawai: te kimi electrophoresis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, uta 1-3 ul

Te tātari ine ine waikawa nucleic
i te nuinga o te wa ka inehia ma te whakamahi i te inenga UV.Tukua ahau ki te whakanui i te tikanga o nga uara e toru o OD260, OD280, me OD230.
·OD260nm: Ko te roangaru absorption o te tihi absorption teitei o te waikawa nucleic, a ko te uara ine pai mai i te 0.1 ki te 1.0.Ki te kore, waimeha, whakakorikori ranei i te tauira kia kawea ki roto i te awhe.
·OD280nm: Ko te roangaru absorption o te tihi absorption teitei o te pūmua me te matū phenolic.
·OD230nm: Ko te roangaru absorption o te teitei absorption tihi o warowaihā.

I muri mai, me korero tatou mo te mahi o ia tohu.Mo te A260, ka taea te whakamahi hei ine i te hua o te waikawa karihi.Ina OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Mo te ma, me titiro ki nga owehenga e kitea ana e tatou: OD260/280 me OD260/230.
· ADN parakore: Ko te OD260/280 he rite ki te 1.8.Ka nui ake i te 1.9, ka tohu he parahanga RNA, a, ka iti iho i te 1.6, ka tohu he parahanga pūmua me te phenol.
· RNA parakore: 1.7
·OD260/230: Ahakoa he DNA, he RNA ranei, ko te 2.5 te uara tohutoro.Ina iti iho i te 2.0, e tohu ana kei te poke te huka, te tote me te mea pararopi.

RNA tapatahi

He mea tino nui ki te ine i te tika o te RNA.Ko te tikanga, he mea tika kia mahia he whakamatautau RNA denaturation gel kia tirohia mena he hononga-rua te kanapa i waenga i te 28S me te 18S RNA.Ka puta mai te roopu tuatoru 5S, ko te tikanga kua timata te RNA ki te whakaheke, engari mo nga korikori.

Raraunga mo te aromatawai kounga RNA: I tua atu i nga whakamatautau i runga ake nei, kei reira ano etahi atu whakamatautau taputapu mo te tika o te RNA, penei i te whakamatautau RQI o te punaha electrophoresis aunoa a Experion, ka taea te kite mena kua whakahekehia te RNA kaore e kitea.

I roto i te rangahau pütaiao, he whakatairite te PCR ine kareoro i waenga i te ira whainga me te ira tohutoro o roto.Na reira, i roto i te tukanga o te tiaki tauira RNA, te tangohanga RNA, me etahi atu, ko te kaupapa tuatahi ko te whakarite i te pono o te RNA.

He pehea te paanga o te pono o te RNA ki te taurite i waenga i te ira whainga me te ira tohutoro o roto ka ngawari te maarama mai i te ahua i raro nei.Ko te paheketanga ka arahi ki te kore o te ira ira, ahakoa ko te kore o te ira tohutoro o roto, ko te kore ranei o te ira whainga, ka nui te paanga ki nga raraunga.

Ko te hoahoa hoahoa o te ira whainga me te ira tohutoro, kaua e pono

Whakamātautau aukati (mehemea ka pehia te uara CT i raro i te kukū teitei, iti ranei, me etahi atu tikanga)

Hei tauira tenei ahua, ko nga uara Ct o nga pihi e rima e whai ake nei.Ko te tohatoha o nga uara CT i waenga i nga pihi kaore i te rite, a ka whakaroa nga uara Ct i raro i nga kohinga teitei me te iti, koinei te take o te aukati PCR.

Ko te kaupapa matua: I roto i te tukanga tangohanga RNA, me whakarere nga pohehe me te whakarite i nga mea tika.

Ko te whakaaro he: Ko te tangohanga RNA anake e whai ana i te hua, me te whakaaro ko te nui ake o te nui o te RNA ka whiwhi, ka pai ake.Inaa, ka mahia e tatou te ine, mena kaore i te tino nui te maha o nga ira, karekau e nui te RNA.He nui ake te nui o te RNA ka tangohia e koe.

Ko te ariā tika ko:Ko te tangohanga RNA me whai i te ma, te tapatahi me te rite.Ka taea e te purema te whakarite kia kore e aukatihia te tuhinga whakamuri o muri mai, ka kore hoki nga raraunga e pa ki te DNA.Ma te tapatahi e whakarite te taurite o nga raupapa whaainga me nga tohutoro o roto.Ma te riterite ka mau te uta tauira.

MIQE (4) – whakawhiti whakamuri
Te pohehe: te whai i te rahinga tauira tauira.
Tikanga ariā: Whaia te riterite (te pumau), ahakoa te nui o te RNA i utaina, ka noho rite tonu te kaha o te whakawhiti whakamuri, me te whakarite ka taea e nga rereketanga o te cDNA te whakaatu i nga rereketanga o te mRNA.
Ka whakamaramatia e matou tenei tukanga ma te hoahoa hoahoa:

Ko te hoahoa hoahoa o te pai o te tuhi whakamuri, kaua e pono
Tuatahi, me mohio tatou ki te rereketanga i waenga i te tukanga whakawhiti whakamuri me te tukanga PCR.He maha nga mahi whakamahana me te whakahiato a PCR, a ka tipu haere te kongakonga whainga;ahakoa karekau he tukanga whakamuri, ka taea e tatou te whakaaro ko te tuhi whakamuri he mea kotahi-ki-tetahi I te wa o te tukuruatanga, he maha nga waahanga o te RNA.

i te mea he maha nga waahanga cDNA Information ka taea, me maarama inaianei, na te mea kua tuhia whakamuri nga kongakonga nui me nga mea iti, a kaore e taea te aro ki tetahi waahanga.A, no te mea he iti te nui o te RNA, he iti ano te nui o te cDNA i whiwhi, kaore i rite ki te PCR, he kaha whakakaha, no reira kaore e taea te kite.

Nga hua electrophoresis cDNA
Tuarua, ko te tikanga, ko te tuhi whakamuri ka mahia kotahi-ki-tetahi, engari karekau he transcriptase whakamuri mai i tetahi kamupene ka tutuki tenei paanga.Ko te tikanga, ko te kaha o te nuinga o nga tuhinga whakamuri ka kopikopiko i waenga i te 30-50%.Mena koinei te take, ka pai ake taatau ki te whai i te pai o te tuhi whakamuri, koinei te mea e hiahia ana matou ki te kite i te ahua: 3 RNA ka whiwhi 2 cDNA, 6 RNA ka whiwhi 4 cDNA, no reira ahakoa te nui o te tauira ka utaina , ko te pai o te tuhi whakamuri he tino pumau.Kare matou e pirangi ki te kite i te ahuatanga kaore e tau te pai o te tuhi whakamuri me te aukati i te kukū teitei.

Na, me pehea te manatoko mena kei te pumau te pai o te tuhi whakamuri?He tino ngawari te tikanga, me mahi he whakamatautau whakatairite: ko tetahi ko te whakahuri i te whakawhiti ki roto i te cDNA i muri i te rearua o te waimehatanga o te RNA, me tetahi atu ko te hanga i te waimehatanga whakarua i muri i te whakahuri whakamuri ki te cDNA, katahi ka mahi i te qPCR kia kite i te pikinga i whiwhi He rite tonu.Hei tauira teitei, me maarama koe i roto i nga hēkona.Ka rite ki te whakaatu i raro nei:

Te waimehatanga o te RNA me te cDNA ki te whakamatautau mena kei te pumau te kaha o te tuhi whakamuri
Whakamuri te transcriptase me te kete
Me pehea e tino pai ai te PCR ine ine tino pai ki te whakamuri me te kete.Ko te transcriptase whakamuri ka wehea kia rua nga momo e ai ki te puna, AMV raneiM-MLV, a he rite tonu a raatau mahi ki tera e whakaatuhia ana i te ripanga.

RNase H mahi
Ko te RNase H ko Ribonuclease H, ko te ingoa Hainamana ko ribonuclease H, he endoribonuclease ka taea te whakamaarama i te RNA i roto i te mekameka ranu DNA-RNA.Kaore e taea e te RNase H te whakamaarama i nga here phosphodiester i roto i te DNA, i te whenu-rua ranei, i te DNA, i te RNA ranei, ara, kaore e taea e ia te keri i te DNA, i te RNA, i te RNA ranei.Ka whakamahia i roto i te whakahiatotanga o te whenu tuarua o te cDNA.

He mea ke.E kii ana matou he mahi RNase H te whakawhitinga whakamuri, ehara i te mea kei roto i te whakawhitinga whakamuri te RNase H, a kaore pea e taea te wehe i te RNase H mai i te whakawhitinga whakamuri, na te ahua o etahi roopu i roto i te whakawhitinga whakamuri Ko tenei mahi na te whakawhitinga whakamuri.

No reira, ahakoa te kaha ake o te tuhi whakamuri o te AMV, ko tana mahi RNase H ka whakaiti i te hua o te cDNA.Ko te tikanga, ko nga kaihanga reagent kei te arotau tonu i a raatau hua ki te whakakore i te mahi RNase H i roto i te transcriptase whakamuri kia taea ai te whakanui ake i te hua o te cDNA.
Te pāmahana whakaene

Ko te hanganga tuarua o te RNA i nga wera rereke
Tirohia te ahua i runga ake nei mo te hanganga tuarua o te RNA i nga pāmahana rereke, ka whakamahi i te taputapu ipurangi mFold hei whakatau i te hanganga tuarua o te kongakonga whainga i raro i te pāmahana motuhake me nga tikanga kukū tote.I te 55 ° C, he tino uaua tonu te hanganga tuarua o te RNA, kaore e taea te mahi whakamuri transcriptase, a, kaore e taea te whakaoti i te hanganga tuarua tae noa ki te 65 ° C, i te mea ko te waahi tino pai o te AMV me te M-MLV he iti rawa atu i tenei paanga.
me aha?Ko te hanganga tuarua ko te taapiri takirua o te tauira ake, e arai ana ki te whakataetae kaha i waenga i te tuatahi me te whakamuri transcriptase me te tauira, ka puta he raupapa raru penei i te iti o te E me te ngoikore o te tukurua.

me aha?Whakanuia noa iho te mahana whakaeneene ka taea.

He maha nga kaihanga reagent kei te whakapai ake i o raatau transcriptase whakamuri ma te miihini ira.Ko etahi ka whakanui ake i te pāmahana tauhohenga, penei i a Jifan me Aidelai, ko etahi ka tango i te roopu kaha o te RNase H enzyme hei whakapai ake i te hononga i waenga i te enzyme me te tauira RNA.Ka taea e te whanaungatanga teitei te kumete i te hanganga tuarua me te panui marie, me te whakapai ake i te pai o te tuhi whakamuri.
Ko te kaupapa matua: He mea nui ake te whakamaoritanga whakamuri ki te whai i te riterite o te pai o te whakamaoritanga whakamuri (kaore e tika kia pai noa nga enzymes engari kia pumau tonu), kaua ki te nui o te tauira i utaina, mena ehara i te PCR ine-nui-nui-a-ringa, kare rawa e taea.Nga cDNA maha.
He maha nga kaihanga kua whakapau kaha ki te whai i te riterite.Hei tauira, ko te nuinga o nga kamupene kua whakaemi i nga tuhinga whakamuri hei kete paerewa mo te hoko, he pai te whiriwhiri.
Hei tauira, nga kete RT Easy Series a Foregene:

RT Easy I(Master premix mo te whenu tuatahi cDNA synthesis kit)

MIQE (5) – nga korero ira ira

Ko te ahua o runga ake nei e whakamarama ana
1. Mēnā e whai hua ana tēnei ira mō ngā whakamātau tukurua ka taea te whakatau mā ngā whakamātau tukurua.
2. Gene ID, e mohio ana koe.
3. Te roa o te ira, te tapeke roa o te ira whainga kaore he raru.I te wa e hoahoa ana i nga kaupapa tuatahi, me whakarite ko te roa o te amplicon kei waenga i te 80-200bp kia pai ake te kaha o te whakakaha.
4. Raupapa Whakatauritenga korero, me whakatairitehia te ira whainga i roto i te putea ira hei aukati i te whakakaha kore-motuhake.
5. Te aroaro o pseudogenes.Ko te pseudogene he raupapa DNA he rite ki te ira noa engari ka ngaro tana mahi.He maha nga wa kei roto i te whanau ira-maha o nga eukaryotes.Ko te tikanga ko te tohu ψ.He kape DNA genomic kore-mahi i roto i te genome e tino rite ana ki te raupapa ira tohu., i te nuinga o te waa kaore i tuhia, kaore hoki he tino tikanga ahupūngao.
6. Te tūnga o ngā pūmua e pā ana ki ngā exons me ngā introns.I nga tau tuatahi, i te wa i whakatauhia e matou te raru o te parahanga DNA, he maha nga wa i aro atu matou ki nga waahi o nga timatanga, exons, me nga introns, me te whakaaro ki te hoahoa i nga kaupapa tuatahi puta noa i nga introns hei karo i te whakakaha DNA.Titiro koa ki te ahua i raro nei: he pango he tohu whakaurunga, he momo puru he tohu o waho, he mawhero he tohu tuatahi, he whero kanapa hei tohu tuatahi mo te awha-roto.

Kaupapa, kaore e pono
He tino pai te ahua o tenei mahere, engari ko te mea pono, i te nuinga o te waa, kaore i te makutu te ahua o nga kaupapa trans-intron i whakaarohia, a ka puta ano hoki te whakakaha kore-motuhake.Na ko te huarahi pai ki te aukati i te poke DNA ko te tango katoa i te DNA.
7. Matapae ritenga.Ma te whakamahi ano i tenei tauira, whakamahia te taputapu ipurangi mFold ki te whakatau i te hanganga tuarua o te kongakonga whaainga i te pāmahana motuhake me te kukū tote.

Ko te hanganga tuarua o te RNA i nga wera rereke
Ko te hanganga tuarua ko te taapiri takirua o te tauira ake, ka kaha te whakataetae i waenga i te tauira tuatahi me te takirua tauira, a ka iti ake te tupono o te herenga tuatahi, ka puta he maha o nga raru penei i te iti o te E me te ngoikore o te tukurua.Ma te matapae rorohiko, mena karekau he raruraru hanganga tuarua, he pai tena.Mena kei reira, ko ta maatau tuhinga whai muri ka korero motuhake me pehea te whakaoti i tenei raru.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides

Mo te PCR ine kareoro, ko te mea tuatahi e raru ana koe ia ra ko te tangohanga RNA, ko te mea tuarua ko te hoahoa tuatahi.
Tuatahi, ka tirohia tonu e matou nga ture mo te hoahoa tuatahi e ai ki te rarangi arowhai MIQE.He tino ngawari ka kata te hunga kino, ka mutu i roto i te rerenga kotahi: kimihia te raupapa me te waahi o te rangahau tuatahi me te tikanga whakarereke.Mo te tikanga purenga tuatahi, he iti noa iho te whakahiato tuatahi i naianei, he tika te qPCR mo te PAGE me nga tikanga purenga o runga ake, a ko nga korero o te taputapu whakahiato kaore he mea nui.He maha nga taangata kei te mahi tuatahi mo nga tau tekau kaore e mohio ko te synthesizer ko ABI3900.
Mo nga maataapono o te hoahoa tuatahi, kaore koe e maumahara, na te mea ka taea e te nuinga o nga rorohiko hoahoa tuatahi, taputapu ipurangi ranei te tiaki i enei raru (e taunakitia ana he taputapu ipurangi primer3.ut.ee/), me te 99.999% o te hoahoa tuatahi kaore i mahia ma te ringa titiro, ka hangaia e te kaituhi nga rau o nga pukapuka tuatahi i ia ra, ki te panui takitahi koe, ka huri te kanohi.
Tena tirohia nga waahanga e whai ake nei i muri i te hoahoanga o nga kaupapa tuatahi:
1. Nga papamahi hoahoa tata ki te pito 3′: Mo te whakamahi i te oligo dT primers mo te cDNA tuatahi-strand synthesis, me te whakaaro ki te pai o te tuhi whakamuri me te pono o te RNA, me hoahoa nga papa tuatahi kia tata ki te pito 3′ kia pai ake ai te kaha whakakaha .Whakamahia he pikitia hei whakamarama e whai ake nei (kare he huarahi ki te mohio ki tenei):

He aha te take i hangaia ai nga papa tuatahi kia tata ki te pito 3′, me kore e tika
2. Uara TM: Ko te uara Tm kei te 55-65°C (no te mea ko te mahi exonuclease te teitei rawa atu i te 60°C), me te GC kei te 40%-60%.
3. BLAST: Hei karo i te whakakaha kore-motuhake o te genome, me whakamahi te Blast mo te manatoko taapiri.

MIQE(7)—te tukanga qPCR

1. kete qPCR
E ai ki nga whakaritenga o te MIQE, me whakamarama maatau i nga ahuatanga tauhohenga katoa i roto i te tuhinga, tae atu ki te whirihoranga o te punaha tauhohenga PCR, he aha te kete e whakamahia ana, ko wai te kaihanga, he pehea te nui o te punaha tauhohenga, ahakoa te whakamahi i te tikanga tae, te tikanga tirotiro ranei, nga tautuhinga kaupapa PCR.Ka tino kitea e nga kaitaraiwa tawhito i te wa e kowhiria ana te kete, ka whakatauhia nga korero o runga ake nei.
I tenei wa, ko te hanga me te hanga o nga kete PCR ine ine korakora he hangarau tino pakeke.I te mea kaore koe e whiriwhiri i nga kaihanga kino rawa atu, kaore i te nui te tupono o nga raru, engari kei te hiahia tonu matou ki te whakapuaki ki a koe etahi waahanga:
Wea-tīmatanga Taq enzyme:Ko te waahanga nui o te PCR ko te wera-tīmatanga Taq enzyme.Ko nga whaakini wera-tīmata i runga i te maakete ka wehea kia rua nga momo, ko tetahi he matū wera-tīmatanga whākōkī (ka taea e koe te whakaaro he paraffin embedding), ko tetahi atu he whaariki wera-tīmata mo te whakarereke antibody (antigen-antibody binding).Ko te whakarerekētanga matū he huarahi moata o te wera-tīmatanga whākōkī.Ka tae ki tetahi pāmahana, ka tukuna e te enzyme tana mahi.Ka whakamahia e te whaariki wera-wera kua whakarereketia e te antibody ki nga tikanga koiora hei aukati i te mahi a te whana.Ka tae ki tetahi pāmahana, ka whakakorehia te antibody ka kore e whakakorikori hei pūmua, ka uru mai te ngohe o te enzyme.

Heoi, he aha te painga o tenei?Ko te take tenei, he tere ake te mahi tuku o nga enzymes kua whakarerekehia e te antibody-modified, na i runga i te ahua o te tairongo, he iti te painga o nga enzymes antibody-modified, na reira karekau he enzyme whakarereke matū i roto i nga kete i runga i te maakete.Mena kei reira, ka mau tonu te hangarau o tenei kaihanga i te wa o te mano tau.
Te kukū katote konupora:He mea nui te kukū katote konupora i roto i te tauhohenga PCR.Ka taea e te kukū katote konupora tika te whakatairanga i te tukunga o te mahi enzyme Taq.Mēnā he iti rawa te kukū, ka tino heke te mahi whākōkī;ki te mea he tiketike rawa te kukū, ka whakanuia te whakakaha kore-motuhake kua whakahiatohia e te enzyme-catalyzed.Ko te kukū o nga katote konupora ka pa ki te whakapouri o nga mea tuatahi, te pāmahana rewa o te tauira me nga hua PCR, na reira ka pa ki te tukunga o nga kongakonga whakakaha.Ko te kukū o nga katote konupora e whakahaeretia ana i te 25mM.Ko te tikanga, mo te kete pai, me pai te whakahaere i te kukū o nga katote konupora.Ko etahi o nga kaihokohoko ka taapiri i te katote konupora chelating agent ki te reagent, ka taea te whakatutuki i te painga o te whakatikatika aunoa o te kukū katote konupora.
Te kukū o te tae korakora:Ko te waikano Korekore, ko te SYBR Kakariki e whakamahia ana e matou, ko te nuinga o te wa ka whakaputa i te korakora ma te here ki te riu iti o te DNA whenu-rua, na te mea ko te here o te tae ki te DNA whenu-rua he kore-motuhake, ara, ki te honoa te DNA whenu-rua ki a ia, ka puta te tohu o te reapapa ki te papamuri, ka pahekohia te DNA ki te papamuri.
PS: Na te mea he maamaa te marama, ko nga hua kei runga i te maakete ka kapi ki roto i nga ngongo centrifuge puataata parauri (penei i te pikitia i raro nei).Heoi, ka raru tenei.He uaua te kite mena ka ngote te wai i te wa e whakatauira ana.I runga i tenei ahuatanga, ko Qingke te tino ratarata-kaiwhakamahi (penei i te pikitia i raro iho nei), a ko te ngongo maramara kei roto i te putea tine puataata.Katahi ka maka ki roto i te putea tine, me te whakaaro ki te pai o te karo i te marama me te tauira.Me whiriwhiri e koe te nama hua tika.Ko te TSE204 he oranga tino utu nui, e hiahia ana ahau ki te whakato tarutaru.

He mea nui ano hoki te kukū o te waikano rewharewha.Mēnā he iti rawa te kukū, karekau te ānau whakakaha e piki ake i te wā o muri mai, ā, kāore i te tino tika;ki te mea he tiketike rawa te kukū, ka haruru te haruru.I te mea ko te PCR ine kareoro e whakawhirinaki ana ki te uara CT, mena kaore i te tika te whakatikatika i te kukū o te waikano korakora, he pai ake te tohu iti i te waahi teitei.Ko te tikanga, ko te kukū o te tae e tika ana te mea pai.

ROX: Ka whakamahia nga waikano ROX ki te whakatika i nga hapa o te tohu rewharewha pai-ki-pai.Ko etahi o nga kaihanga taputapu e hiahia ana ki te whakatikatika, ko etahi kaore.Hei tauira, ko te whakamahi i te taputapu whakakaha PCR Wā Tuturu a Thermo Fisher Scientific e hiahia ana ki te whakatikatika, tae atu ki te 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, aha atu.
Kei roto hoki i te QPCR Mix a Foregene te waikano ROX, he pai mo te whakamahi i nga momo tauira.

Waa Tuturu PCR Kit-Taqman

Te maimoatanga here hauwai ngoikore: Ko te maimoatanga o nga here hauwai ngoikore he mea hangarau.Kaore he mea i panui i nga pukapuka o nga kete maha, engari kaore tetahi o ratou i whakahua i tenei kaupapa.I roto i te meka, he mea tino nui.Ko te huinga o nga turanga ka whakawhirinaki ki te kaha o nga here hauwai.Ko nga here hauwai kaha he whakakaha noa, me nga here hauwai ngoikore ka arahi ki te whakakaha kore-motuhake.Ki te kore e taea te whakakore pai nga here hauwai ngoikore, kaore e taea te karo i te whakakaha kore-motuhake.I roto i te waahanga o te kaituhi, he iti noa nga kamupene kua kite i tenei raru.Ina hoko koe i te kete, ka taea e koe te titiro mena kua whakaaro koe he otinga mo tenei kete mo te kete e hiahia ana koe ki te whiriwhiri.

Rōrahi tauhohenga: Ko te punaha 20-50ul te nuinga o te whakamahi, a ko nga pukapuka iti ka puta he hapa.I te nuinga o te korero, ka taunaki nga tohutohu kete ki te whakamahi i nga pukapuka tauhohenga PCR.Kaua e mohio me te whakamahi i nga pukapuka iti hei penapena utu.te whāinga o.Ko te rōrahi e taunakihia ana e nga kaihokohoko kua tino whakamatauria, a tera pea kaore e taea e ratou te whakaoti i te raruraru o nga hapa i puta mai i nga pukapuka iti.
2. Ko te kaihanga me te nama tuhinga o te pereti ngongo
Kei te mohio nga tangata katoa ki te maapono o te PCR ine korakora.Ko te kohinga o te rewharewha ka mahia ma roto i nga potae ngongo PCR.I te wa e whiriwhiri ana i nga taputapu PCR, whakarongo ki nga waahanga e rua: he pai te tuku marama me te pai mo te taputapu.Ko te tikanga, he pai nga papa me nga ngongo o nga rama auraki, engari me ata whiriwhiri e koe mo te urutaunga, mena ka kore e taea e koe te whakamahi i te taputapu.

4. Te taumata teitei o te matauranga

MIQE (8)—QPCR whakamanatanga
Koinei te kaupapa matua o te qPCR!He maha nga toa kua taka ki te onepu i konei.Ae ra, he waimarie ano koe, he ngawari nga ira i akohia e koe, na reira i maanu koe i roto i te ana hukapapa ma te hau.Ko nga korero whakamana o te qPCR ko te whakamatau i te pono o nga raraunga.Ka whakarārangihia e mātou ngā kōrero manatoko e whai ake nei:

1.Whakamātautau motuhake
Ka whakamatauria te motuhake o te whakanui ira ira ma te tirotiro mena he roopu kotahi te pikitia electrophoresis;manatoko raupapa;rewa ana ki te kite mena he kotahi te mapi tihi;whakaūnga nakunaku whākōkī me ētahi atu tikanga.
I konei, ka aro atu ki tka tātarihia e ia te whakakaha kore-motuhake ma te whakamahi i te tikanga o nga pihi whakarewa.I te nuinga o te korero, ka hoahoa tatou i nga kaupapa tuatahi, ko te rahi o te kongakonga hua e hiahiatia ana kia 80-200bp, na te mea ka rewa te rewa o te hua PCR ki te 80-85 °C awhe.No reira, mena he maha nga tihi, me whai etahi atu hua whakakaha kore-motuhake;ki te puta te tihi i raro i te 80°C, ka kiia he dimer tuatahi;ki te puta te tihi ki runga ake i te 85°C, ka kiia he poke DNA, he nui ake ranei te whakakaha kore motuhake o nga kongakonga nunui.
Tuhipoka: I etahi wa kotahi noa te tihi i te 80°C.I tenei wa, me u ki tenei kaupapa.Ko te ahua ko nga hua whakakaha he dimer tuatahi katoa.

Anau rewa noa (te tihi kotahi kaore he whakakaha motuhake)

Anau rewa raruraru (te whakakaha kore-motuhake o nga tihi tinihanga)
【Tuhinga Take】

He tihi nui, engari he tino taumaha te dimer tuatahi
Ko te pihi rewa kotahi te tihi o te ahua i raro nei ka ngawari te tinihanga i o kanohi, me te whakaaro he whakamatautau tino pai, engari he he rawa te hua.I tenei wa, me titiro tatou ki te pāmahana rewa.Ko te pāmahana teitei kei raro iho i te 80°C, he tino riima-dimer.

Karekau he kongakonga whainga, nga dimer tuatahi katoa
Anei, e kore e taea e taku tungane te mutu.Ko te pikitia i raro nei he whakaahua i tangohia me te waea pukoro i tukuna mai e te scumbag ki ahau.Ko nga reagents i whakamahia e ia ko nga rama e whakamahia nuitia ana i roto i te umanga.I huri ia mai i tetahi waitohu T-prefix ki tetahi atu tohu T-prefix.Ki taku whakaaro kua pohehe kee koe.Ka tangi mai te tangata kino ki ahau: “Ko te reagent i whakamahia i te pikitia tuatahi he pai rawa, he kotahi te tihi.I muri mai, i muri i te whakamahi i te reagent i tohua e koe, ka rite ki te pikitia tuarua, me nga tihi whakauru.Nau ahau i whakapouri.“
Wehea nga kauwhata e rua.I te titiro tuatahi, kotahi te tihi o tetahi, a, ko tetahi he tihi takirua.Kore noa, he pai te tihi kotahi.He pono tera?
He kino atu i a Dou E, ki te hoatu e au nga pikitia e rua ki te pikitia i raro nei, ka marama tonu koe.Ko te tikanga, he ngawari noa tatou ki te pararutiki i tenei momo pikitia.I muri mai i te ata tirotiro, i kitea e matou: ko te tihi o te ahua tuatahi kei te 75°C, he dimer tuatahi;ka puta te tihi o te ahua tuarua i te 75°C me te 82°C, i te iti rawa kei reira Ka puta te hua.

Ko nga pikitia o nga urupare mai i nga akonga
Na ko te raru nui ehara i te raru o nga reagents, engari ko te raru o te hoahoa tuatahi.I te wa ano, ka whakaatu ano ko etahi tohu nui ehara i te kounga rino, me te whakaatu ano i nga korero a taku tuakana i mua: Ehara i te tohu reagent e tautoko ana i to tuhinga.Na to tuhinga i tautoko te waitohu o nga reagents.Whakaarohia, ki te kore e whakarereketia e te scumbag nga reagents, ka tukuna nga raraunga he ki te hautaka, a he aitua tera.
2. Uara Ct o te mana patea
Kaua e whakamaarama, mena he uara Ct te mana patea, he parahanga?Heoi, me marama tonu koe ko tehea mana paatea he uara Ct.Mena he NTC, ko te tikanga he DNA kee penei i te whakakino reagent.Mena he NRT, ko te tikanga ko te RNA kua tangohia he poke DNA.
3. Anau Paerewa
Tae atu ki te taipapa me te tātai tātaitanga, ka taea te tatau te pai o te PCR ma te tauira.Ko te whakamätautau tino tika ko te pikinga o te pihi paerewa kia whakatata ki te 3.32, me te R² kia tata ki te 0.9999.
4. Awhe hihiri raina
He ahorangi te awhe hihiri o te tauhohenga.E ai ki te tauira i whakamahia ki te whakaputa i te anau paerewa, me whakauru te awhe hihiri kia 5 neke atu nga rōnaki kukū, me te aro ki te huringa o nga uara Ct i nga rōnaki kukū teitei me nga rōnaki kukū iti.
5. Tirohanga tika
Ko nga huringa i roto i nga hua qPCR, ara, he ngoikore te tukurua, ara, he kino te tika, na te maha o nga take, tae atu ki te mahana, te kukū me te mahi.Ko te tika o te qPCR ka iti ake te whakahaere i te mea ka heke te nama kape.Ko te rereketanga o roto-whakamatautau, me wehe tenei rereketanga hangarau mai i te rereketanga koiora, ka taea e nga tauira koiora te whakatika tika i nga rereketanga tatauranga i nga hua qPCR i waenga i nga roopu, i nga maimoatanga ranei.Ina koa mo nga whakamatautau tātaritanga, me ripoata te tino tika o waenga-whakamatau (te tukurua) puta noa i nga waahi me nga kaiwhakahaere.
6. Te kaha ki te rapu me te LOD (i roto i te qPCR maha)
Ko LOD te kukū iti rawa o te 95% o nga tauira pai kua kitea.Arā, ko te kukū o te LOD kei roto i te huinga o nga tauira ira ira kaua e neke ake i te 5% o nga tauhohenga rahua.I te wa e mahi ana i te tātaritanga qPCR multiplex, ina koa mo te kitenga tukutahi o nga huringa ira, polymorphisms ranei, me whakaatu te multiplex qPCR i nga taunakitanga e kore e taupatupatuhia te tika o nga kongakonga whaainga maha i roto i te ngongo kotahi, te kitenga maha me te kitenga ngongo kotahi Kia rite tonu te kaha me te LOD.Ina koa ka whakanuia i te wa kotahi nga ira whainga-nui me nga ira taumata-iti, me aro ki tenei raru.
Nga raruraru me nga otingaKo te tikanga, ko nga raru e pa ana ki te qPCR patuiro ka aro ki nga waahanga e whai ake nei:
·whakakaha kore motuhake
· He uaua ki te kowhiri i te kukū tuatahi me te raru ki nga riima-ahuru
·Kare i te tika te paemahana annealing
· Ko te hanganga tuarua ka pa ki te kaha whakakaha
whakakaha kore motuhake
whakakaha kore-motuhakeka puta , ka whakaarohia mehemea kaore i te pai te hoahoa tuatahi, engari ki te kore koe e tere ki te whakarereke i nga kaupapa tuatahi, ka taea e koe te whakamatau i nga tikanga e whai ake nei (kei te piri ano te kaupapa):
·Whakanuia te mahana whakaene - ngana kia kore e taea te pupuri nga here hauwai ngoikore;
·Whakapotohia te wa whakaroa me te whakaroa - whakaitihia te tupono o nga here hauwai ngoikore;
·Whakaitihia te kukū tuatahi – whakaitihia te tupono o te herenga o nga reanga tuatahi me nga rohe kore e whaaia;
He iti te kaha o te whakakaha
Ko te ahua ke atu ki te whakakaha kore-motuhake – te iti o te kaha o te whakakaha, me nga tikanga mo te iti o te kaha whakakaha he rereke noa:
· Whakaroa i te wa whakaene me te whakaroa;
· Hurihia ki te PCR e toru-taahiraa me te whakaiti i te pāmahana whakaene;
·Whakanuia te kukū tuatahi;
Ps: He maha nga tauira paetahi i whanau i te 90s kaore e pai ki te ako me pehea te tarai i nga whakamatautau, me te tumanako ka taea e te kete te whakaoti i te raru (mehemea kei te hiahia koe ki te haere ki tetahi kamupene reagent ki te mahi rangahau me te whakawhanaketanga i muri i te tohu paetahi), he pono, he penei ano te whakaaro o nga kaihanga reagent. ngoikore H-hononga take absorption.Kia ngawari te whakaoti rapanga, me panui tonu te hunga kuare i te whakaurunga o te kamupene reagent ki te kite mena he take kei te tango i nga here hauwai ngoikore.
He uaua ki te whiriwhiri i te kukū tuatahi me te raru ki nga riima-dimer
Tikanga 1: I te nuinga o te korero, ko nga tohutohu kete mo te qPCR kua taunaki nga punaha me te taunaki i nga kohinga tuatahi.
Tikanga 2: Te patuiro ma te tautuhi i te rōnaki kukū tuatahi.Ko te pikitia i raro nei i tahaetia mai i tetahi kamupene hei whakaatu.Ko te ahua i raro nei e whakaatu ana i nga hua ine ine korikori i hangaia me nga rōnaki kukū tuatahi e toru (100nM, 250nM, 500nM) me nga rōnaki kukū tauira e wha (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Ko te uara Ct o nga hua whakamatautau ka tohua e whai ake nei:

Ko te Whiriwhiringa Kukunga Tuatahi Whakakotahitia ia kuhanga tuatahi ki te rarangi e whai ake nei:

Ka kitea te kowhiringa o te kukū tuatahi, he pai ake te hononga raina o te kukū tuatahi o te 100nM me te 250nM, me te hononga ahorangi o te kukū tuatahi o te 500nM he ahua kino.I roto i te 100nM me te 250nM, he iti te uara Ct o 250nM, no reira ko te 250nM te kukū tuatahi.I te nuinga o te waa ka kitea nga tohu-a-maamaa kino i te pihi rewa.Ka pehea mena ka kore e taea e nga papa tuatahi te karo i nga tohu tuatahi?
Tikanga 3: Whakaitihia te nui o nga mea tuatahi me te whakanui ake i te pāmahana whakaene (kaore e tika kia whakamaarama).
Ko te 60°C te uara matakite o te pāmahana whakaene.Ki te kore koe e tino mohio, me pehea te kowhiri i te pāmahana whakaeneene pai ake?He rite te whakautu ki te kowhiringa o te kukū tuatahi -whakamātautau rōnaki.Tangohia he pikitia mai i te kamupene Bio-rad hei whakaatu i te raru.Mo te whakakaha o tetahi mahanga i whngaia, whakaritea kia waru nga rekoata o te pāmahana, kia toru nga tukuruatanga mo ia waahanga, a ko te pihi whakakaha kua riro e whai ake nei:

kowhiringa pāmahana whakaene:
·70°C, 69°C—Ko te tikanga, kaore e taea te whakakotahi i nga mea tuatahi, no reira karekau he whakakaha.
·67.3°C – He iti noa te whakanui i te timatanga, he nui te uara Ct.
·64.5°C——Ka heke te uara Ct.
·I te 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, me te 55.0°C, ko nga uara Ct i te tikanga he pumau, engari he rereke nga uara o te rewharewha whakamutunga.
Me pehea te whiriwhiri?Kaupapa: Ko te kaupapa tuatahi ko te uara Ct teitei ake.Mo te uara Ct rite, whiriwhiria he pāmahana whakaenee teitei ake hei karo i te hauruarua me te whakakaha kore-motuhake.Ahakoa he nui ake te uara rewharewha i te 55°C, tera pea he dimer, he whakakaha kore-motuhake ranei kei roto.
Engari ki te rite koe ki te mohio ki a koe, ka tino whakaaro koe: Ma te arorau, mena he tino motuhake te tauhohenga PCR, mena ka nui ake te kukū tuatahi i te whakaritenga iti, karekau he painga o nga tohu teitei me te iti, penei i nga waikano fluorescent me nga dNTP.Inaa, i te mea ka tino arotauhia te pāmahana whakaenee, ka tino whakaitihia te paanga o te kukū tuatahi ki te uara Ct.

He pai te arotautanga o te pāmahana whakahiato, ka whakaitihia te paanga o te kukū tuatahi ki te CT
Ko te hanganga tuarua ka pa ki te kaha whakakaha
Me tango te pikitia mai i a Bio-rad hei whakaatu i te raru.Ka hoahoa ano i te rōnaki pāmahana hei whakanui i te ira me te hanganga tuarua.

Ka puta te hanganga tuarua
Ka kitea i te hekenga o te rōnaki pāmahana, ka timata te puta mai o nga hua ka anga whakamua te uara Ct, ka eke ki te uara iti rawa ki te 60.7°C, katahi ka heke te rōnaki pāmahana, ka nui ake te uara Ct.Engari, ka piki ake te pāmahana, ka tuwhera te hanganga tuarua, ka piki ake te kaha o te whakanui.I muri i te taenga ki tetahi pāmahana, ko te whakanui ake i te pāmahana kaore e taea te whakapai ake i te kaha whakakaha.Na te mea kaore e taea te whakakotahi i nga mea tuatahi i tenei wa.No reira,titiro mo te pāmahana me te uara Ct iti rawa, ko te pāmahana tino pai mo te whakanui i te tauira hanganga tuarua!Ko te tikanga, me mohio nga wairangi mohio mehemea kaore e tika ana, he pai ake te whakarereke i nga waahanga tuatahi me te karo i te rohe hanganga tuarua.
5. Taumata tono
MIQE—Tatari Raraunga

Ko te tātaritanga raraunga ko te nuinga ka tukuna e te taputapu PCR ine korakora.I roto i te tuhinga o mua, he maha nga mahi wetewete raraunga kua mahia, penei i te mana patea, kua whakamaramatia i roto i te hoahoa o te whakamatautau.Kua whakamaramatia nga ira tohutoro o roto, nga nama tukurua, aha atu., i konei ka whakamaramahia e matou te tono o te qPCR.
Kei te whakamahia nuitia te qPCR, a ko te whakamohiotanga whakamatautau me te tātaritanga waikawa nucleic nga ahuatanga e tino whakamahia ana.
inenga tino
Ko te rangitaki (te kuhunga tuatahi) he hononga raina me te maha o nga huringa.Ka taea te tango i te anau paerewa mai i te paerewa e mohiotia ana te tau kape tuatahi, ara, ka taea te whiwhi i te hononga raina o te tauhohenga whakakaha.E ai ki te uara Ct o te tauira, ka taea te tatau te kukū o te tauira.Te nui o nga tauira hei whakauru.

Tikanga Tatau Ine Tino
Ko te inenga tino tika me whai i runga i te pihi paerewa.Ki te hanga i te pihi paerewa, me whai paerewa.I te nuinga o te wa, ko te paerewa he plasmid ka riro mai ma te kati i te ira whainga.He aha te mea he plasmid?No te mea ko te DNA plasmid porowhita te tino pumau.Waimeha i te hua paerewa i roto i te 5 ki te 6 rōnaki kia rite ki te ōwehenga rearua (te waimehatanga 10), ka aro ki te taurite i te diluting.Kia taka te uara Ct i waenga i te 15-30.

Whakaritenga paerewa
I te wa ano, ko te tauira ka whakamatauria me whakamaarama ano (maharatia te take waimeha), me taka hoki te uara Ct i waenga i te 15-30.Ko te hua paerewa + ko te tauira hei whakamatautau ka whakauruhia ki runga i te miihini.Whai muri i te oma, ka mahia he pihinga paerewa me te matū paerewa, ka kawea mai nga tauira hei whakamatautau ki roto i te pihi paerewa hei tatau i te kukū.
Hepatitis B huaketo HBV ine he ine tino angamaheni, ka taea te tatau i te nama kape huaketo i roto i te 1ml o te toto.
Te tatauranga o te nama kape
Te kukū tauira hei whakamatautau (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × tauwehe waimeha
Tauira taimaha rāpoi = tau o nga turanga × 324
Te tau kape o te tauira hei whakamatautau (nga kape/ul) = te kukū o te tauira hei whakamatautau / te taumaha ngota o te tauira × 6 × 1014

Tikanga tatau mo te nama kape

Ko nga mea i runga ake nei ko te tikanga tatau mo te whakatau i te rahinga.He rapanga pangarau tenei ka taea te whakaoti i muri i te puta o te kura tuarua, a ko nga rapanga pangarau ka whakatauhia e te rorohiko.Ki te kore koe e marama, ka taea e koe te haere mai ki te whakawhitiwhiti korero.
inenga whanaunga
Ko te ine inenga e whakamahia ana i roto i nga rangahau pūtaiao.E hia nga wheori kei roto i te 1ml o te toto, a he huaketo DNA, he kaupapa tino whakatau tenei: ka taea te whakatau i te nui o te toto, a, he ahua pumau te huaketo DNA.Heoi, he uaua ki a tatou te whakataurite i te maha o nga kape tuhi o tetahi ira i roto i te rau, na te mea he uaua ki te whakatau i te rahi, te taumaha me te ngawari o te rau, he uaua ki te whakatau i te nui o te RNA kua tangohia, he uaua hoki ki te whakatau i te kaha o te whakahuri whakamuri, ara, ahakoa he aha te mahi ka whai pepeke nga raraunga whakamatautau ka kore e taea te whakamahi.
Na reira, me whakauru te inenga whanaunga i tetahi huānga:te ira tohutoro o roto.
I etahi atu kupu, ko te ine ine he tino whakataurite i waenga i te ira whainga me te ira tohutoro o roto.Ka whakatauritea i roto i te kiko kotahi me te pūtau kotahi, he iti noa te awe o te rahi tauira, te nui o te tangohanga RNA, te pai o te whakawhiti whakamuri, me te pai o te PCR.Na te iti o te rahi o te tauira, he iti te iti o nga ira tohutoro o roto me nga ira whainga.Koinei te take i whakanuia e matou te riterite me te pumau i mua.
Ko nga ira tohutoro o roto ko te tikangaira tiaki whare( ira tiaki-whare), e tohu ana ki te karaehe o nga ira e mau tonu ana te whakaatu i roto i nga ruma katoa, me o raatau hua hei pupuri i nga mahi oranga o nga pūtau.
Kaua e whakapoauau tenei ariā.Ko nga ira tiaki whare he kupu mahi koiora, ko nga ira tohutoro o roto he kupu hangarau whakamatautau.Ko nga ira tiaki whare me tuku whakamana i mua i te kowhiri hei ira tohutoro o roto.
Hei tauira, i tohua e matou etahi ira tiaki whare i roto i te ahua i raro nei hei whakamatautau i o raatau taumata korero i roto i nga momo momo kopa, ka kitea he rereke nga taumata whakahuatanga o te β-2-microglobulin i era o era atu ira e toru, na reira kaore e taea te whakamahi hei ira tohutoro o roto.

I muri i te mohio ki te mahi whakatikatika o te ira tohutoro o roto, e rua nga algorithms i ahu mai na te whakaurunga o te ira tohutoro o roto.
·tikanga pihinga paerewa takirua
·2 – △△Ct tikanga (tikanga whakatairite uara CT)
Mena kei te pirangi koe ki te ako i nga momo me nga mahi ira, tena koa whakarerea te rangahau mo te algorithms me te whakamahi tika i nga tauira, te whakamahi tika ranei i nga miihini;Mena he tangata tika koe i roto i te pangarau me te miihini, tena koa koa.
tikanga pihinga paerewa rua
Te ine i te ira whainga me te ira tiaki whare o te tauira mana me te tauira ka whakamatauria ma te anau paerewa, katahi ka tatauhia te uara whanaunga i runga i te tauira tatau, ko te taumata korero whanaungatanga.
Painga: he tātari ngawari, he ngawari noa te arotautanga whakamatautau
Raruraru: Mo ia ira, me hanga ia a tawhio noa o nga whakamatautau he anau paerewa
Te Whakamahinga: Ko tetahi o nga tikanga e rua e whakamahia nuitia ana, e mohiotia ana i roto i nga tikanga ine ine i roto i te ako i te ture whakaputa ira
Ko te tauira e whai ake nei:

Ko nga tauira e whai ake nei:

Tātaihia te rahinga whanaunga i runga i te hua ine
2 – △△Ct tikanga (tikanga whakatairite uara CT)

Painga: Kaore he take ki te hanga i te pihi paerewa
Nga ngoikoretanga: E kiia ana he tata ki te 100% te kaha whakakaha;ko te inenga paerewa he <5%, a, ko te anau paerewa me te kaha o ia whakakaha ka kiia he rite tonu;he uaua ake te arotautanga o nga tikanga whakamatautau.
Te Whakamahinga: Ko tetahi o nga tikanga e rua e whakamahia nuitia ana, e mohiotia ana i roto i nga tikanga ine ine i roto i te ako i te ture whakaputa ira

Ko te tikanga, ko te kaha o te whakakaha i te nuinga o te waa e kore e taea te 1. Tikanga Whakatikatika: Mena ka mohio tatou he rite tonu te kaha o te ira whainga me te ira tohutoro, engari kaore i te rite te kaha o te whakakaha ki te 1, katahi ka taea te whakatika 2－△△Ct hei: (1+E )－△△Ct.l. 1.95－△△Ct
I tenei wa, kua mutu nga korero e pa ana ki te PCR ine korakora.