Ko te PCR ine korikori (e mohiotia ana ko TaqMan PCR, ka kiia i muri nei ko FQ-PCR) he hangarau ine ine waikawa karihi hou i whakawhanakehia e PE (Perkin Elmer) i te United States i te tau 1995. Ko tenei hangarau he mea hangai ki runga PCR tikanga ma te taapiri i nga rangahau tapanga kareoro.Ka whakatauritea ki te PCR ngawari, he maha nga painga o te FQ-PCR ki te mohio ki tana mahi ine.Ko te whakaaro o tenei tuhinga ki te whakaahua poto i nga ahuatanga, nga maapono, nga tikanga, me nga whakamahinga o te hangarau.
1 Nga ahuatanga
Ko te FQ-PCR ehara i te mea he nui noa iho te PCR noa, engari na te tono o nga rangahau fluorescent, ka taea e ia te kite tika i te huringa o te tohu kareoro i te wa e whakanuia ana te PCR na roto i te punaha whakahaere photoelectric ki te whiwhi i nga hua ine, e hinga ana i te maha o nga ngoikoretanga o te PCR tikanga, na reira ano hoki te tino motuhake o te hangarau hangarau DNA me te tino tika o te hangarau hangarau.
Hei tauira, ko nga hua PCR whanui me titiro ma te hiko hiko kiato me te ethidium bromide ki te rama ultraviolet, ma te polyacrylamide gel electrophoresis me te whakakikorua hiriwa.Ehara i te mea he maha nga taputapu, engari he wa me te whakapau kaha.Ko nga piro i whakamahia Ethidium bromide he kino ki te tinana o te tangata, a ko enei tikanga whakamatautau uaua ka whai waahi mo te parahanga me nga hua teka.Heoi, ko te FQ-PCR anake te whakatuwhera i te taupoki kotahi i te wa e utaina ana te tauira, a ko te tukanga o muri ko te mahi kati-kore-kore, e kore e hiahiatia te PCR i muri i te tukatuka, me te karo i te maha o nga ngoikoretanga i roto i nga mahi PCR tikanga.I te nuinga o te waa ka whakamahia e te whakamatautau te ABI7100 PCR pahikara waiariki i hangaia e te kamupene PE.
E whai ake nei nga ahuatanga o te taputapu: ① Te whakamahi whanui: Ka taea te whakamahi mo te DNA me te RNA PCR ine hua, rangahau whakaaturanga ira, rapunga pathogen, me te arotautanga o nga tikanga PCR.② Te tikanga ine ine ahurei: Ma te whakamahi i nga maataki kua tohua, ka whakaemihia te nui o te rewharewha me te huringa PCR i muri i te whakaihiihi taiaho, kia tutuki ai te kaupapa o te ine.③ He tino pai te mahi: Ko te 9600 PCR te hikohiko waiariki i hangaia, ka whakahaeretia e te rorohiko 1 ki te 2 haora hei whakaoti i te whakakaha me te ine o nga tauira 96 aunoa me te tukutahi.④ Karekau he hiahia mo te hiko hiko: Karekau he take ki te waimeha me te electrophoresis te tauira, whakamahia noa he rangahau motuhake kia kitea tika i roto i te ngongo tauhohenga.⑤Karekau he parahanga i roto i te paipa: Ko te ngongo tauhohenga kua oti te whakakii me te punaha kawe whakaahua hiko kua tangohia, na reira kaore he take e maaharahara mo te parahanga.⑥Ko nga hua ka taea te whakaputa: ko te awhe hihiko ine ki te rima ota te nui.No reira, i te mea kua pai te whakawhanaketanga o tenei hangarau, kua whakanuia e te maha o nga kairangahau pūtaiao, kua whakamahia ki nga waahi maha.
2 Nga tikanga me nga tikanga
Ko te kaupapa mahi o te FQ-PCR ko te whakamahi i te mahi exonuclease 5′→3′ o Taq enzyme ki te taapiri i tetahi tirotiro kua tapaina ki te punaha tauhohenga PCR.Ka taea e te rangahau te whakakotahi ki te tauira DNA kei roto i te raupapa tuatahi.Ko te 5′mutunga o te rangahau kua tapaina ki te ira tukunga fluorescence FAM (6-carboxyfluorescein, te teitei o te fluorescence i te 518nm), a ko te pito 3 kua tapaina ki te Ko te roopu tinei kareoro TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence emission peak′3begin to 582 peak to 582 peak o te 582 peak. te rangahau mai i te whakaroa i te wa o te whakakaha PCR.I te wa e mau tonu ana te tirotiro, ka pehia e te roopu tineia te whakaputanga o te rewharewha o te roopu whakaputa.Ina wehea te roopu whakaputa mai i te roopu tiini, ka hiki te aukati, ka piki ake te kiato whatu i te 518nm ka kitea e te punaha rapu fluorescence.Ina tapahia te rangahau, ka tukuna te awenga tinei ka tukuna te tohu rewharewha.I nga wa katoa ka kapehia te tauira, ka tapahia he rangahau, me te tukunga o te tohu rewharewha.I te mea he hononga kotahi-ki-tetahi i waenga i te maha o nga fluorophores kua tukuna me te maha o nga hua PCR, ka taea te whakamahi i tenei tikanga ki te ine tika i te tauira.Ko te taputapu whakamatautau te whakamahi i te ABI7100 PCR i hangaia e te kamupene PE, ka taea hoki te whakamahi i etahi atu paihikara waiariki.Mena ka whakamahia te punaha tauhohenga momo tauhohenga ABI7700 mo te whakamatautau, i muri i te otinga o te tauhohenga, ka taea te hoatu tika nga hua ine ma te tātari rorohiko.Mēnā ka whakamahi koe i ētahi atu paihikara waiariki, me whakamahi koe i te kaitahuri rewharewha ki te ine i te tohu rewharewha i roto i te ngongo tauhohenga i te wa ano ki te tatau RQ+, RQ-, △RQ.Ko te RQ + e tohu ana i te tauwehenga o te kaha o te rama o te roopu rerenga o te ngongo tauira ki te kaha o te rama o te roopu tiini, ko te RQ- te tohu o te tauwehenga o nga mea e rua i roto i te ngongo patea, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) e tohu ana i te nui o te huringa tohu rewharewha i te wa o te PCR I muri i te tukatuka raraunga ka taea te quanti.Na te whakaurunga mai o nga maataki kareoro, kua tino pai ake te motuhake o te whakamatautau.Me tutuki te hoahoa rangahau i nga tikanga e whai ake nei: ①Ko te roa o te rangahau kia 20-40 nga turanga hei whakarite i te motuhake o te here.②Ko te ihirangi o nga turanga GC kei waenganui i te 40% me te 60% hei karo i te taarua o nga raupapa nucleotide kotahi.③ A ape i te ranu, inaki ranei ki nga mea tuatahi.④ Ko te pumau o te herenga i waenga i te tirotiro me te tauira he nui ake i te pumau o te herenga i waenga i te tuatahi me te tauira, no reira ko te uara Tm o te rangahau kia 5°C teitei ake i te uara Tm o te tuatahi.I tua atu, ko te kukū o te rangahau, te homology i waenga i te rangahau me te raupapa tauira, me te tawhiti i waenga i te rangahau me te tuatahi ka pa ki nga hua whakamatautau.
Hua e pā ana:
Haina Tuturu PCR Easyᵀᴹ-Taqman Kaihanga me te Kaiwhakarato |Foregene (foreivd.com)
Wā tuku: Oketopa-15-2021
