Te motuhake o te kitenga
I te nuinga o nga wa, ko te kaupapa o te hoahoa tuatahi ko te whakanui i te motuhake o te PCR.Ka whakatauhia tenei e te nui ake, iti ake ranei te awe o nga taurangi maha.Ko tetahi taurangi nui ko te raupapa i te 3′mutunga o te tuatahi.
Ko te mea nui, ko nga whakamatautau PCR i hangaia mo te motuhake ka kaha ake te pupuri i te kaha ki runga i te whānuitanga hihiri, na te mea kaore te whakamatautau e whakaputa i nga hua whakakaha kore-motuhake, na reira ka whakataetae ki nga reagents PCR, ka aukati ranei i te tauhohenga whakakaha matua.
Ko te tikanga, i etahi wa, ehara i te mea motuhake te mea nui, hei tauira, ko te whainga ko te ine i nga hononga tata engari ko nga pathogens rereke, te hoahoa motuhake, te arotautanga me nga paerewa manatoko.
Ko te kurupae rewa he tikanga paerewa mo te aromatawai i te motuhake o nga amplicons, i te iti rawa i roto i nga tikanga o te whakanui i te whaainga kotahi.Heoi, me whakanui ake ka pohehe pea nga pihi rewa na te mea, hei tauira, ka pangia e nga paanga whakakotahitanga o nga kaimatai iti me te iti o nga kohinga tauira.
P5 |E whakaatu ana te anau rewa i nga nekehanga Tm i puta mai i nga kitenga e rua o nga rahinga rereke o nga DNA e rua.
A. I nga kukū teitei ake (ad)), karekau he dimer tuatahi i muri i te otinga o te inenga qPCR.I te hekenga o te kukū tauira ki te 50 kape (e), ka puta mai he hua kore-motuhake, ka noho ko ia anake te hua i te kukū iti rawa (f).
B. He rite tonu nga Tms i tuhia e te whakamatautau i nga kuhanga katoa o te whaainga, a karekau he riima tuatahi i kitea ahakoa te iti rawa o te kukū (5 kape).I te whakamahi i enei tikanga rapu e rua, karekau he hua whakakaha i kitea i roto i nga NTC.
Ko te P5 e whakaatu ana i nga pihi weriweri i whiwhi mai me nga tauira kei roto te tauira i nga kuhanga rereke.Ko te P 5a e whakaatu ana i nga kohinga iti rawa e rua, ko nga Tms o nga hua whakakaha kore-motuhake ka puta he iti ake i tera o nga amplicons motuhake.
Maamaa, kaore e taea te whakamahi pono tenei tikanga rapu ki te kimi i nga whaainga kei roto i nga kukū iti.
He mea whakamiharo, ko nga NTC, ara, nga tauira karekau he DNA, kaore i tuhia nga hua whakakaha (kore-motuhake), e tohu ana ka taea e te DNA genomic papamuri te uru ki te whakakaha/polymerization kore-motuhake.
I etahi wa kaore e taea te whakatika i nga papamuri me te whakakaha kore-motuhake, engari he maha nga wa ka taea te hoahoa i tetahi tikanga rapunga karekau he whakakaha motuhake i roto i tetahi kukū tauira me te NTC (P 5b).
I konei, ahakoa ko te tuhi i te whakakaha o te kukū whainga me te Cq o te 35 ka puta he anau wetewete motuhake.Waihoki, kaore nga NTC i whakaatu i nga tohu o te whakanui kore-motuhake.I etahi wa, ka ti'aturi pea te whanonga kitenga i runga i te waipiro whaea, a ko te whakakaha kore-motuhake anake ka kitea i roto i etahi titonga parepare, tera pea e pa ana ki nga rereketanga Mg2+ rereke.
Te pumau o te kitenga
Ko te arotautanga o Ta he mahi whai hua i roto i te manatoko me te mahi arotautanga o te kitenga qPCR.He tohu tika mo te pakari o te huinga tuatahi ma te whakaatu i te pāmahana (te awhe pāmahana ranei) e whakaputa ana i te Cq iti rawa me te kore e whakanui i te NTC.
Ko te rerekeetanga e rua ki te wha-whaa i roto i te tairongo kaore pea i te mea nui mo nga tangata whai tohu mRNA teitei, engari mo nga whakamatautau mate, he rereke te rereketanga o nga hua kino me nga hua kino teka.
He rereke pea nga ahuatanga Ta o nga kaimatai qPCR.Ko etahi o nga whakamatautau kaore i te tino pakari, a, ki te kore e mahia i raro i te uara Ta tino pai o nga mea tuatahi, ka tere topa.
He mea nui tenei na te mea he maha nga raru o tenei momo kitenga i roto i te ao tuuturu, a ko te ma o te tauira, te kukū o te DNA, te noho mai ranei o etahi atu DNA kaore pea i te tino pai.
I tua atu, ka rereke pea te nama kape i te whaanui, ka rereke pea nga reagents, taputapu kirihou, taputapu ranei i era i whakamahia i te wa e whakarite ana i te whakamatautau.
P6|Ko te rōnaki pāmahana e whakaatu ana i te pakaritanga rerekē o te kitenga PCR.
A. Whakamahia te Sensifast SYBR mastermix a Bioline (nama putumōhio BIO-98050) ki te mahi PCR i runga i te cDNA i mahia mai i te RNA roro tangata.
B. Whakamahia te taputapu CFX qPCR a Bio-Rad ki te tuhi i te mapi whakakaha me te ānau memeha o te apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Kauwhata whakakaha me te ānau rewa o ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Kauwhata whakakaha me te ānau whakangawari o GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs i tuhia ki te rerekee o te wera whakaene, e whakaatu ana i te rereketanga o te Cq i tuhia i raro i te rōnaki pāmahana 7C.
E whakaatu ana a P 6 i te hua o te whakamatautau kino, i mahia ai te qPCR ma te whakamahi i te rōnaki Tas i waenga i te 59C me te 67C (P 6a), ma te whakamahi i nga tohu tuatahi mo nga ira e toru o te roro tangata.
Ka kitea mai i te kauwhata whakakaha ake he tawhiti rawa atu nga papaamata Opalin i te mea pai na te mea he kuiti rawa te awhe Ta tino pai (Whakaahua 6b), ara, ka marara noa nga Cqs, na reira ka tino whakatairitehia nga Cqs ki to ratou tino pai Cqs Iti.
Ko tenei tikanga rapunga kaore i te iu, ka arahi pea ki te whakakaha iti.No reira, me hoahoa ano tenei takirua tuatahi.I tua atu, e whakaatu ana te wetewete o te anau rewa (whakauru) he raru ano pea te motuhake o tenei tikanga rapunga, na te mea he rereke te pihi rewa o ia Ta.
Ko te tikanga rapunga ACSBG1 e whakaatuhia ana i roto i te P 6c he pakari ake i te tikanga rapunga Opalin i runga ake nei, engari kei tawhiti tonu mai i te pai, me te mea pea ka taea te whakapai ake.
Heoi ano, ko ta matou whakakoi kaore he hononga e tika ana i waenga i te pakari me te motuhake, na te mea ko te anau wetewete i puta mai i tenei tikanga rapu e whakaatu ana i te uara teitei i roto i nga Tas katoa (whakauru).
I tetahi atu taha, he nui ake te manawanui o te whakamatautau pakari, e whakaputa ana i nga Cqs rite ki te whānuitanga o te Tas, penei i te whakamatautau GFAP e whakaatuhia ana i te P 6d.
Ko te rereketanga o nga Cq i whiwhi i roto i te awhe 8 nga nekehanga Celsius he iti iho i te 1, a, ko te anau wetewete (whakauru) e whakau ana i nga ahuatanga kitenga i tenei awhe pāmahana.He mea tika kia mohio ko te Taa kua tatauhia me te awhe Ta tonu ka tino rerekee.
He maha nga aratohu i hangaia hei awhina i nga kairangahau ki te hoahoa i nga kaupapa tuatahi e whai hua ana, ko te nuinga o enei i ahu mai i nga ture kua roa nei, me te aro nui ki te 3'mutunga o nga timatanga.I te nuinga o te wa ka tūtohu kia whakauruhia he G, C ranei ki te pito 3' me nga turanga G, C ranei e rua (rakau GC), engari kaua e neke ake i te rua o nga turanga 5 whakamutunga.
I roto i nga mahi, ka taea e enei ture te arahi i nga kairangahau, engari kaore i te tika i raro i nga ahuatanga katoa.
P7 |Ko te 3′mutunga o te tuatahi he iti te paanga ki te motuhake me te pai ranei.
A. Te tuunga o nga mea tuatahi mo te ira tangata HIF-1α (NM_181054.2).
B. Whakamahia te waipiro whaea Agilent Brilliant III SYBR Green (Cat. No. 600882) hei whakanui i nga mea whakamatautau e ono.
C. Kauwhata whakakaha me te ānau rewa i tuhia e te taputapu CFX qPCR a Bio-Rad me nga timatanga 3′mutunga.Ka whakaatuhia nga NTC ki te whero.
D. Cqs record o ia mea whakamatautau
Hei tauira, ko te hua o te P 7 he whakahē i te ture mutunga 3′.Ko nga hoahoa katoa he rite tonu nga hua, e rua noa nga huinga tuatahi e arahi ana ki te whakakaha kore-motuhake i roto i te NTC.
Engari, kaore e taea e matou te tautoko i te paanga o te topenga GC, na te mea i tenei keehi, ko te whakamahi i te A, T ranei hei morahi o nga turanga 30 kaore e whakaiti i te motuhake.
Ko te Whakamatau C, kei te mutu te tuatahi o te F i te GGCC, i tuhi i nga Cq i roto i nga NTC, e tohu ana tera pea ka hiahia tetahi ki te karo i enei raupapa i te mutunga 30.Ka whakamihi matou ko te huarahi anake hei whakatau i te raupapa 3′mutunga pai rawa atu o te takirua tuatahi ko te arotake i etahi o nga tauira tuatahi o te kaitono.
Te kaha whakakaha
Ko te mea nui, ahakoa e kore e taea e te kitenga PCR kore-motuhake te tino motuhake, ka taea te whakatikatika me te whakanui i te kaha o te whakakaha i roto i nga huarahi maha ma te huri i te whanariki, te waipiro whaea, nga taapiri, me nga tikanga eke pahikara.
Hei arotake i te pai o te kitenga PCR, he pai ake te whakamahi i te waimeha rangatū o te 10 ki te 5 nga wa ki te waikawa nucleic i whngaia, ara, te "tikanga pihi paerewa".
Mena ka whakamahia nga amplicons PCR, nga whaainga DNA waihanga ranei hei whakaputa i te anau paerewa, me konatunatua nga waimeha rangatū o enei taumata ki te nui tonu o te DNA papamuri (pēnei i te DNA genomic).
P8 |Anana waimeha ki te arotake i te kaha o te PCR.
A. Whakamahia nga tohu tuatahi mo te HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA me R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC me te Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (nama putumōhio 600882) mo te PCR me nga ahuatanga o te pihi rewa.
B. 100 ng RNA i whakamuri i te tuhi, 2 nga wa i diluted, me nga tauira cDNA kua diluted rangatū i 5 nga wa ki te 1 ng DNA genomic tangata.Ka whakaatuhia te kurupae rewa ki te whakauru.
C. Ko te tauhohenga RT, te waimeha, me te waimeha rangatū i tukuna mo te tauira cDNA tuarua, a he rite nga hua.
Ko te P 8 e whakaatu ana i nga pihinga paerewa e rua, ma te whakamahi i te tikanga rapu i runga i nga tauira cDNA rereke e rua, ko te hua he rite te pai, mo te 100%, me te uara R2 he rite ano, ara, ko te tohu o te pai i waenga i nga raraunga whakamatautau me te raina whakahekenga, te raraunga ranei Te tohu o te raina.
He rite nga pihi paerewa e rua, engari kaore i te rite.Mena ko te kaupapa ko te ine tika i te whaainga, me tohu kaore e whakaaehia te whakarato i te tatauranga nama kape me te kore e whakamarama i te koretake.
P9 |Te ine koretake e pa ana ki te ine ma te whakamahi i te anau paerewa.
A. Whakamahia nga papa tuatahi mo te GAPDH (NM_002046) ki te mahi i te PCR me te rewanga tikanga.F: ACAGTTGCCATGTAGACC me R: TAACTGGTTGAGCACAGG me Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nama putumōhio BIO-98050).
B. Tūtohi whakakaha, ānau rewa me te ānau paerewa kua tuhia ki te taputapu CFX qPCR a Bio-Rad.
C. Paerewa kauwhata ānau me te 95% wā māia (CI).
D. Ko te nama kape me te 95% mokowhiti maia o nga uara Cq e toru i ahu mai i te anahanga waimeha.
E whakaatu ana a P 9 mo te whakamatautau kua arotauhia, ko te rereketanga o te anau paerewa kotahi e 2 nga wa (95% te wa maia, te iti ki te teitei), koinei pea te rereketanga iti rawa ka taea te tumanako.
Hua e pā ana:
Wā tuku: Hepetema-30-2021
