Pūtau Tika RT qPCR Kit—SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Pūtau Reri Kotahi-taahiraa Kete qRT-PCR
Whakaahuatanga
Ka whakamahia e tenei kete he punaha putunga lysis motuhake ka taea te tuku tere i te RNA mai i nga tauira pūtau ahurea mo nga tauhohenga RT-qPCR, na reira ka whakakore i te mahi purei RNA e pau ana te wa me te mahi.Ko te tauira RNA ka taea i roto i te 7 meneti noa iho.Ko te 5×Tika RT Mix me te 2×Ko nga reagents qPCR Mix-SYBR tika e whakaratohia ana e te kete ka tere me te whai hua te whiwhi i nga hua PCR ine i te waa.
5×Tika RT Mix me te 2×Ko te Direct qPCR Mix-SYBR he kaha te aukati aukati, a ka taea te whakamahi i te lysate o nga tauira hei tauira mo RT-qPCR tika.Kei roto i tenei kete te RNA high-affinity Foregene reverse transcriptase, me Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, tauhohenga buffer, PCR optimizer and stabilizer.
Whakatakotoranga
200×20μl Rxns, 1000×20μl rxn
Nga waahanga kete
| Wāhanga I | Kaipupuri CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Kaipupuri ST | |
| Wahi II | Pūkōmuru DNA |
| 5× Direct RT Mix | |
| 2× Tikanga qPCR Mix-SYBR | |
| 50× ROX Waikano Tohutoro | |
| RNase-Free ddH2O | |
| Tohutohu | |
Nga waahanga me nga painga
■He ngawari me te whai hua : me te hangarau Cell Direct RT, ka taea te tiki tauira RNA i roto i te 7 meneti noa.
■ He iti te tono tauira, tae noa ki te 10 nga pūtau ka taea te whakamatautau.
■ Te whakaputanga teitei: ka taea te kite tere i te RNA i roto i nga pūtau i whakatipuria i roto i nga papa 384, 96, 24, 12, 6-puna.
■ Ka taea e te Kaimuku DNA te tango tere i nga momo ira i tukuna, ka tino whakaiti i te paanga ki nga hua whakamatautau ka whai ake.
■ Ko te punaha RT me te qPCR kua arotauhia ka pai ake te whakamaaramatanga whakamuri o te RT-PCR e rua, me te PCR motuhake ake, ka kaha ake te atete ki nga aukati tauhohenga RT-qPCR.
Te tono kete
Te whānuitanga o te tono: nga pūtau ahurea.
- RNA i tukuna e te tauira lysis: e tika ana ki te tauira RT-qPCR o tenei kete.
- Ka taea te whakamahi i te kete mo nga kaupapa e whai ake nei: te tātari whakaaturanga ira, te manatoko o te awenga wahangu o te ira i waenga i te siRNA, te tirotiro tarukino, aha atu.
Hoahoa
Rokiroki me te ora o te Papa
Ko te wahanga I o tenei kete me pupuri ki te 4 ℃;Ko te waahanga II me penapena ki te -20 ℃.
Ko te Foregene Protease Plus II me penapena ki te 4℃, kaua e whakatio ki te -20 ℃.
Reagent 2×Ko Direct qPCR Mix-SYBR me penapena ki -20℃i roto i te pouri;ki te whakamahia auau, ka taea hoki te penapena ki te 4℃ mo te rokiroki mo te wa poto (whakamahia i roto i nga ra 10).
Tikanga Tuturu PCR maataapono hoahoa tuatahi
Primer Whakamua me te Primer Whakamuri
Mo PCR Wā Tuturu, he mea nui te hoahoa tuatahi.Ko nga kaupapa tuatahi e pa ana ki te motuhake me te kaha o te whakanui PCR, a ka taea te hoahoa ma te tohu ki nga kaupapa e whai ake nei:
Te roa o te tuatahi: 18-30bp.
Te ihirangi GC: 40-60%.
Uara Tm: Ka taea e te rorohiko hoahoa tuatahi, penei i te Primer 5, te uara Tm o te tuatahi.Ko nga uara Tm o nga timatanga o runga me te taha whakararo kia tata tonu.Ka taea hoki te whakamahi i te tauira tatauranga Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).I te wa e mahi ana i te PCR, ka tohua te pāmahana i raro iho i te uara Tm tuatahi o te 5 °C hei pāmahana whakaenee (ka taea e te pikinga o te pāmahana whakaenee te whakanui ake i te motuhake o te tauhohenga PCR).
Nga mea tuatahi me nga hua PCR:
Ko te roa o te hua whakakaha PCR tuatahi he pai ki te 100-150bp.
Me karohia nga tauira hoahoa i te waahanga hanganga tuarua o te tauira ka taea.
Me karo i te hanga 2 neke atu ranei nga turanga taapiri i waenga i nga pito 3′ o nga puna tuatahi o te awa ki raro.
Kare e taea e te turanga tauranga tuatahi 3′ te noho me te 3 taapiri G, C ranei.
Ko nga mea tuatahi kaore he hanganga taapiri, ki te kore ka hangaia he hanganga makawe, ka pa ki te whakanui PCR.
Me tohatoha te ATCG kia rite ki te raupapa tuatahi, me karohia te turanga 3′ hei T.
Tāpiritanga 1: Pūtau Direct RT-qPCR Kit mōkihi tāpiri wāhanga
1.Rongoa Raihana Pūtau
|
| |||
| Nga waahanga kete (24-puna puna lysis / puna) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| WahiI | Kaipupuri CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Kaipupuri ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| WahiII | Pūkōmuru DNA | 400 μl | 1 ml × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| Nga waahanga kete (20 μl pūnaha tauhohenga) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Direct RT Mix | 800 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml × 2 |
|
| ||
| Nga waahanga kete (20 μl pūnaha tauhohenga) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Tikanga qPCR Mix-SYBR | 1 ml × 2 | 1.7 ml × 6 |
| 50× ROX Waikano Tohutoro | 40 μl | 200 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml | 10 ml |
Pukapuka Tohutohu:
