Te whakahekenga nui o Haina Tirohanga Teitei One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2
Whakaahuatanga kete:
◮He ngawari me te whai hua: me te hangarau Cell Direct RT, ka taea te tiki tauira RNA i roto noa i te 7 meneti.
◮He iti te tono tauira, he iti rawa te 10 nga pūtau ka taea te whakamatautau.
◮He nui te whakaputanga: ka taea e ia te kite tere i te RNA i roto i nga pūtau i whakatipuria ki nga papa 384, 96, 24, 12, 6-puna.
◮Ka taea e te Kaimuku DNA te tango tere i nga momo ira i tukuna, ka tino whakaiti i te paanga ki nga hua whakamatautau ka whai ake.
◮Ko te punaha RT me te qPCR kua arotauhia ka pai ake te whakamaaramatanga whakamuri o te RT-PCR e rua, me te PCR motuhake ake, ka kaha ake te atete ki nga aukati tauhohenga RT-qPCR.
Kua mohio matou ki te kaiwhakanao.Ko te wikitoria i te nuinga o nga tiwhikete tino nui o tana maakete mo te whakahekenga nui o Haina Te Taapiri Teitei One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Ko te kounga ko te oranga o te wheketere, Ko te arotahi ki te tono a nga kaihoko ko te puna o te oranga me te whakawhanaketanga o te kamupene, Ka piri matou ki te pono me te whakaaro pai ki te mahi, me te tumanako ki to taenga mai!
Kua mohio matou ki te kaiwhakanao.Ko te wikitoria i te nuinga o nga tiwhikete tino nui o tana maaketeHaina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Ka oati to taatau kamupene: nga utu whaitake, te wa whakaputa poto me te pai o te ratonga i muri i te hoko, ka mihi ano matou ki a koe ki te toro ki to maatau wheketere i nga wa katoa e hiahia ana koe.Ko te hiahia inaianei he pakihi pai me te wa roa!!!
Whakaahuatanga
Ka whakamahia e tenei kete he punaha putunga lysis motuhake ka taea te tuku tere i te RNA mai i nga tauira pūtau ahurea mo nga tauhohenga RT-qPCR, na reira ka whakakore i te mahi purei RNA e pau ana te wa me te mahi.Ko te tauira RNA ka taea i roto i te 7 meneti noa iho.Ko te 5×Direct RT Mix me te 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents e whakaratohia ana e te kete ka taea te whiwhi tere me te whai hua i nga hua PCR ine i te waa.
5×Direct RT Mix me 2×Direct qPCR Mix-SYBR he kaha te aukati aukati, a ka taea te whakamahi i te lysate o nga tauira hei tauira mo RT-qPCR tika.Kei roto i tenei kete te RNA high-affinity Foregene reverse transcriptase, me Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, tauhohenga buffer, PCR optimizer and stabilizer.
Whakatakotoranga
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Nga waahanga kete
| Wāhanga I | Kaipupuri CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Kaipupuri ST | |
| Wahi II | Pūkōmuru DNA |
| 5× Direct RT Mix | |
| 2× Tikanga qPCR Mix-SYBR | |
| 50× ROX Waikano Tohutoro | |
| RNase-Free ddH2O | |
| Tohutohu | |
Nga waahanga me nga painga
■ He ngawari me te whai hua : me te hangarau Cell Direct RT, ka taea te whiwhi tauira RNA i roto i te 7 meneti noa.
■ He iti te tono tauira, tae noa ki te 10 nga pūtau ka taea te whakamatautau.
■ Te whakaputanga teitei: ka taea te kite tere i te RNA i roto i nga pūtau i whakatipuria i roto i nga papa 384, 96, 24, 12, 6-puna.
■ Ka taea e te Kaimuku DNA te tango tere i nga momo ira i tukuna, ka tino whakaiti i te paanga ki nga hua whakamatautau ka whai ake.
■ Ko te punaha RT me te qPCR kua arotauhia ka pai ake te whakamaaramatanga whakamuri o te RT-PCR e rua, me te PCR motuhake ake, ka kaha ake te atete ki nga aukati tauhohenga RT-qPCR.
Te tono kete
Te whānuitanga o te tono: nga pūtau ahurea.
- RNA i tukuna e te tauira lysis: e tika ana ki te tauira RT-qPCR o tenei kete.
- Ka taea te whakamahi i te kete mo nga kaupapa e whai ake nei: te tātari whakaaturanga ira, te manatoko o te awenga wahangu o te ira i waenga i te siRNA, te tirotiro tarukino, aha atu.
Hoahoa
Rokiroki me te ora o te Papa
Ko te wahanga I o tenei kete me pupuri ki te 4 ℃;Ko te waahanga II me penapena ki te -20 ℃.
Ko te Foregene Protease Plus II me penapena ki te 4 ℃, kaua e whakatio ki te -20 ℃.
Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR me penapena ki -20 ℃ i roto i te pouri;ki te whakamahia pinepine, ka taea hoki te penapena i te 4 ℃ mo te rokiroki mo te wa poto (whakamahia i roto i nga ra 10) .Kua mohio matou ki te kaihanga.Ko te wikitoria i te nuinga o nga tohu tino nui o tana maakete mo te whakahekenga nui o Haina Te Whakaaetanga Teitei One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Ko te kounga ko te oranga o te wheketere, Ko te aro ki te tono a nga kaihoko ko te puna o te oranga me te whakawhanaketanga o te kamupene, Ka piri matou ki te pono me te whakaaro pai o te mahi, me te titiro whakamua ki to taenga mai!
He utu nuiHaina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Ka oati to taatau kamupene: nga utu whaitake, te wa poto o te whakaputa me te pai o te ratonga i muri i te hoko, ka mihi ano matou ki a koe ki te toro ki to maatau wheketere i nga wa katoa e hiahia ana koe.Ko te hiahia inaianei he pakihi pai me te wa roa!!!
QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman
Cat.No.DRT-01021/01022
Mo te RT-qPCR tika pūtau e whakamahi ana i te ≤ 1000,000 pūtau
Whakataki hua
Ka whakamahia e tenei hua he punaha lysis buffer ahurei hei tuku tere i te RNA mai i nga tauira pūtau ahurea mo nga tauhohenga RT-qPCR, me te whakakore i te wa me te mahi purenga RNA mahi, me te 7 meneti noa ki te tiki i te tauira RNA e hiahiatia ana, me te 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman e whakaratohia ana e te kete ka taea te tere me te whai hua i nga hua PCR mo te wa tika.
5× Direct RT Mix me te 2× Direct qPCR Mix-Taqman he kaha te aukati i te aukati, a ka taea e ia te huri pai me te whakakaha ake ma te whakamahi i te lysate o te tauira hei ine hei tauira.Kei roto i te reagent te Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, Reaction Buffer, PCR Optimizer me te Stabilizer, ka taea te whakamahi me te lysis buffer kia tere me te ngawari ki te kite i nga tauira, me nga ahuatanga o te hikaka teitei, te motuhake me te pumau.
āhuatanga hua
He ngawari, whai hua te hangarau RT Direct Pūtau e 7 meneti te roa ki te tiki tauira RNA.
He iti nga whakaritenga tauira, ka taea te whakamahi i te iti rawa o te 10 nga pūtau whakatipu hei whakamatautau.
Te whakaputanga teitei mo te whiwhinga tere o te RNA o nga pūtau ahurea penei i te 384, 96, 24, 12, me nga pereti 6-puna.
Ka taea e te Kaimuku DNA te tango tere i nga ira i tukuna, ka tino whakaiti i te paanga ki nga hua whakamatautau ka whai ake.
Ko nga punaha RT me te qPCR kua arotauhia ka taea e te RT-PCR te rua-taahiraa me te pai ake o te whakamaoritanga whakamuri, te motuhake, me te kaha ake o te aukati i te aukati tauhohenga RT-qPCR.
Te tono kete
Te whānuitanga o te tono: Nga pūtau whakatipu.
Ko te tauira lysis i whakamaoritia te RNA: whakamahia anake hei tauira RT-qPCR e rua-taahiraa.
Ka taea te whakamahi kete mo nga kaupapa e whai ake nei: te tātari ira ira, te whakamatautau allele, te tirotiro tarukino, aha atu.
Nga here kete
Ko nga kongakonga kua whakanuia ≤ 300 bp.
Ka whakamahia nga kete ki nga pūtau whakatipu hou.
Mana kounga hua
E ai ki te Pūnaha Whakahaere Kounga Katoa a FOREGENE, he maha nga wa ka whakamatauria ia roopu o nga kete raupapa Cell Direct RT-qPCR ki te whakarite i te pono me te pumau o te kounga o ia kohinga kete.
Kei roto kete
| QuickEasyTM Pūtau Tika RT-qPCR Kit-Taqman | ||||
| Nga waahanga kete20μl qPCR Reaction System | DRT-01021 | DRT-01022 | Tuhipoka | |
| 200 T | 1000 T | |||
| Wahi I | Kaipupuri CL | 4 ml | 20 ml |
Raihana pūtau |
| Foregene Protease Plus II | 80 μl | 400 μl | ||
| Kaipupuri ST | 400 μl | 1 ml × 2 | ||
|
Wahi II | Pūkōmuru DNA | 80 μl | 400 μl | |
| 5×Hanga RT Mix * | 160 μl | 800 μl | RT | |
| 2× Tikanga qPCR Mix-Taqman * | 1 ml × 2 | 1.7 ml × 6 | qPCR | |
| 20×ROX Waikano Tohutoro | 40 μl | 200 μl | ||
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml | 10 ml | ||
| Pukapuka Tohutohu | 1 wahi | 1 wahi | ||
*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ka taea te hoko motuhake, ka whakaratohia nga korero i roto i te Apitihanga 1 (WAHI 13).
Nga tikanga rokiroki
1. Nga Tikanga Tukunga
Ko te tukanga katoa o te kawe pouaka pouaka hukapapa iti te pāmahana, ki te whakarite kei roto te kete i te ahua <4 °C.
2. Nga tikanga rokiroki
Whakaorangia te wahanga I ki te 4°C me te Wahanga II ki te -20°C.
Ko te Foregene Protease Plus II me penapena ki te 4°C, kaua e whakatotoka i te -20°C.
Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman ka rongoa ki te -20°C, ki te 4°C ranei mo te wa poto mena ka whakamahia auau (i roto i nga ra 10).
Ko nga korero mo te waahanga kete
Buffer CL: Ka whakarato i te taiao e hiahiatia ana mo nga tauhohenga lysis pūtau.
Buffer ST: Ka whakamutua te matū kaha i roto i te lysate hei karo i nga paanga ki te RT o muri mai.
DNA Kōmuru: Te tango DNA, te painga o te tango i te ira ira ki nga whakamatautau ka whai ake.
5× Direct RT Mix: Kei roto te hononga RNA teitei Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, and reverse transcription primers for best alignment (Random Primer, Oligo(dT)18Primer).
Foregene Protease Plus II: I roto i te horopaki o te lysis buffer, ka lysed nga pūtau ki te tuku waikawa nucleic.
2× Direct qPCR Mix-Taqman: Kei roto i tenei reagent Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, tauhohenga buffer, PCR optimizer, and stabilizer.
20× ROX Waikano Tohutoro: I te nuinga o te waa e whakamahia ana i runga i nga taputapu whakakaha PCR mo te ABI, Stratagene me etahi atu kamupene, ka whakamahia hei whakatika i te rereketanga i waenga i nga ngongo PCR me nga ngongo i puta mai i nga hapa PCR dosing.Ko te 20× ROX Reference Dye concentration e hiahiatia ana mo nga taputapu rereke he rereke, a ka taea e te kaiwhakamahi te taapiri kia rite ki te kukume o te taputapu.
RNase-Free ddH2O: RNase-kore he wai parakore kua whakahoroa mo te rua-taahiraa RT-qPCR tauhohenga.
Whakatupato:(Kia ata panuihia nga whakatupato i mua i te whakamahi i te kete)
Kia tupato ki te tikanga whakahaere o te whakamatautau kia kore ai e paheke te whakawhiti i waenga i nga tauira.
Kia tupato ki te ma o te taiao whakamatautau me nga taputapu hei karo i te paru RNase me te whakahekenga RNA.
Tangohia nga tauira pūtau hou, kua tiakina pai ranei, kaua rawa e whakamahi i nga tauira pūtau kua whakamaroke-whakatio.
5× Tikanga qPCR Mix,2× Tikanga qPCR Mix-Taqman me karo i te whakatio-whakarewa tonu, ki te kore ka pa ki te tuhi whakamuri me te pai o te PCR.
Prepakaii muamahi
Me ata panui nga tohutohu i mua i te whakamahi i tenei kete.He ngawari, he watea, he tere hoki te whakahaeretanga o te kete RT-qPCR Cell Direct, a ko nga tohutohu e whakarato ana i nga korero katoa mo te kete katoa me te whakamahi tika.Whakapaia koa nga rawa me nga taputapu whakamatautau i mua i te whakamahi.
Nga rauemi me nga taputapu whakamatautau
◆ Pūtau ahurea.
◆ 1.5 ml ranei 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifuge ngongo, RNase-/DNase-Free matamata, 0.2 ml ngongo qPCR horomata.
◆ miihini qPCR, pipette, centrifuge papa (≥13,400×g) (i runga i nga hiahia whakamatautau), etc.
Haumaru
◆ Ko tenei hua mo nga kaupapa rangahau pūtaiao anake, kaua e whakamahia mo nga kaupapa rongoa, haumanu, kai me nga kaupapa whakapaipai.
◆ Ina whakamahi matū, mau kakahu e tika ana mo te taiwhanga, karapu, karaehe whakamarumaru, aha atu.
Mahinga kaiarahi
Ka taea te hoko motuhake nga punaha Rairangi Pūtau, nga punaha RT, me nga kete taapiri otinga tauhohenga qPCR, mo nga korero kei roto i te Apitihanga 1 (WAHAU 13).
Aratohu mahi
A: Tauira tuku RNA
1.I mahia mua nga pūtau: Horoia te pereti ahurea pūtau ki te PBS makariri, katahi ka lyse nga pūtau (10-106), 106 atu i te nui o nga pūtau, ka tūtohutia Foregene te Pūtau he kete RNA Isolation Kit te Tapeke (DE-03111) ranei Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) mo te tangohanga RNA me te purenga.
1.1.Pūtau piri (24- paraharaha pai hei tauira)
1.1.1.Whakatauhia te maha o nga pūtau o ia puna, whakatauhia ko te 1 × 10 te maha o nga pūtau5, me te whakamahi i te paipa hei tango i te momo tikanga mai i te rihi ahurea.
1.1.2.Tāpirihia te 200 μl o te 1 × PBS i mua i te whakamatao ki ia puna.Kaua e paipa tonu me te tango i te PBS mai i nga puna.Hurihia te pereti me te tango i te nui o te PBS ka taea.Haere ki te taahiraa 2.
1.1.3.He rīhi ahurea pūtau rerekē, he ripanga tau tohutoro 1-1 ranei i roto i te rihi ahurea pūtau i taapirihia i mua i te whakamatao 1 × PBS mo te horoi pūtau.
Ripanga1-1: inenga PBS mo nga maha o nga pūtau
| Momo pereti ahurea | Te maha o nga pūtau / puna | 1 × PBS/ pai |
| 6-pai | 1× 106 | 1000 μl |
| 12-pai | 2×105 | 400 μl |
| 24-pai | 105 | 200 μl |
| 96-pai | 104 | 50 μl |
| 384-pai | 5×103 | 25 μl |
Tuhipoka：Ki te whakarite kia u nga pūtau piri，he nui te mate o nga pūtau i karo i te wa e horoi ana.
1.2.Ngā pūtau whakatārewa, pūtau piri rānei i whakatipuria ki ngā pereti kore-porous
1.2.1.Ko nga pūtau piri kua whakatipuria ki roto i nga pereti puna kore-maha (ka timata mai i te taahiraa 1.2.2 nga waahi whakatārewatanga), ka kohia, ka wehea nga ruma kia rite ki te tikanga kohinga pūtau, ka tuu ki roto i te pereti ahurea, i te ngongo centrifuge ranei;ki te whakamahia te trypsinization, me mahi centrifugation ki te kohikohi i nga pūtau me te tango i te toenga trypsin, ka taapirihia nga pūtau kua whakatarewahia ki roto i nga pūtau takitahi hei whakamarara i nga pūtau.
1.2.2.Whai muri i te maha o nga pūtau kua tatauhia, ka tohatohahia nga pūtau 1×105 kotahi ki te ngongo centrifuge, kohikohi pūtau mā te centrifugation i te 1000 × g mo te 10 min.
1.2.3.Taapirihia te 200 μl PBS ki te ngongo centrifuge, kaua e paipa i nga wa maha, me te aspirated tika te PBS.haere ki te taahiraa 2. (Mehemea he uaua ki te whakaheke, ka whakatarewahia ano nga pūtau, ka taea te mahi 1000×g centrifuged 10 min i muri i te rukenga i te supernatant, ka haere te pire pūtau ki te taahiraa 2)
2.Cell lysis: Tango Buffer CL, tona pāmahana equilibrated ki te pāmahana rūma, DNA Kōmuru me Foregene Protease Plus II, rite ki te ripanga e whai ake nei 1-2 pūnaha lysis rite: (Lysis otinga kua rite mo te whakamahi).
Ripanga1-2: wehenga whakarite pūnaha (Tuhipoka: i roto i te takahanga i runga i te hukapapa)
| Waehanga (Rangi Matua Raihana Pūtau) | pereti 6-puna | 12-pai pereti | 24-pai pereti | 96-pai pereti | 384-pai pereti |
| 1000 μl / puna | 400 μl / pai | 200 μl / pai | 50 μl / pai | 25 μl / pai | |
| Kaipupuri CL | 960μl | 384μl | 192μl | 48μl | 24μl |
| Pūkōmuru DNA | 20μl | 8μl | 4μl | 1μl | 0.5 μl |
| Foregene Protease Plus II | 20μl | 8μl | 4μl | 1 μl | 0.5 μl |
3. ( 24 –well plate hei tauira ) Pipette 200 μl o te pūtau lysis master uru ki ia poka, Whakatangihia kia 5-10 nga wa, Whakanuia ki te pāmahana rūma (20-25 ℃ ) mo te 5 min.
Tuhipoka：Hei karo i te hanganga o nga mirumiru, koa i te wa i whakatikatikahia te paipa paipa i te tauine paipa ki te 200μl iti iho ranei.Ka ahua kapua nga ruma i muri i te lysis, he mea noa.
4.(24 –well plate as an example) ka whakauruhia ki roto i te wai 20 μl Buffer ST (he rereke nga punaha lysis Buffer ST kua tapirihia ki te rahinga e whakaatuhia ana i te Ripanga 1-3), he 5-10 nga wa o te pipetting, i te pāmahana rūma(20-25 ℃) i whakakororia mo te 2 min.
Tuhipoka：Ko te pito o te pipette ka tukuna ki raro i te mata, me te whakauru i te lysate，ki te karo i te hanganga o nga mirumiru, koa i te wa i whakatikahia te paipa pipette tauine ki te 200μl iti iho ranei.
Ripanga 1-3：Taapirihia te Buffer ST
| Kaipupuri ST | 6- pereti pai | 12- pereti puna | 24- pereti puna | 96- pereti puna | 384- pereti puna |
| 100 μl / pai | 40 μl / pai | 20 μl / pai | 5 μl / pai | 2.5 μl / pai |
5.Ka whakamahia te lysate mo nga whakamatautau RT-qPCR e whai ake nei.Ki te kore e taea te mahi i nga whakamatautau ka whai ake, me pupuri ki runga tio kia kaua e neke ake i te 2 haora, ka penapena ki te -20 ℃, -80 ℃ ranei (kaua e neke ake i te toru marama).
B: Whakaritenga punaha RT
1.Tangohia te 5 × Direct RT Whakaranuhia ka tuu ki runga i te pati hukapapa, kia rewa noa, ka ata uru mo te whakamahi i muri mai;tangohia te RNase-Free ddH2O ka rewa ka tuu ki runga i te pati tio hei whakamahi i muri mai.Whakaritehia te punaha tauhohenga ki runga tio kia rite ki te Ripanga 2-1 i raro nei.
Ripanga 2-1: Whakaritenga o te punaha tauhohenga RT
| Pūnaha RT taapiri ihirangi | Me te nui | Te kukū whakamutunga | |
| 5 × Direct RT Mix | 4μl | 8 μl | 1 × |
| Rairangi Pūtau (Tairaira RNA) | 4 μl | 8 μl | Tāpirihia te whakatikatika awhe (10 -40%) |
| RNase-Free ddH2O | 12 μl | 24 μl | - |
| Rōrahi Tapeke | 20 μl | 40 μl | - |
2.I muri i te otinga o te whakatakotoranga o te punaha, ka konatunatua marie me te centrifuged poto i roto i te ripanga e whai ake nei 2 -2 tikanga tauhohenga RT tauhohenga.
Ripanga 2-2: RT Tauhohenga ahuatanga tautuhinga
| Hipanga | Te pāmahana | wā | ihirangi |
| 1 | 42 °C | 15-30 min | te whakahiato cDNA |
| 2 | 95 °C | 5 min | Ko te transcriptase whakamuri kua whakakorehia |
| 3 | 4 °C | N/A |
3.I muri i te otinga o te tauhohenga, ka tuu tika te hua tauhohenga ki runga i te hukapapa mo te qPCR, waiho koa te tiaki mo te wa roa -20 ℃ ranei -80 ℃ .
Tuhipoka: Na te whakamahinga o te tauira kaore i purea, ka puta pea nga rerenga ma ki te hua tuhi whakamuri.He ahuatanga noa tenei.Purihia te supernatant mo nga whakamatautau ka whai ake.
Ko te otinga tauhohenga RT ka taapirihia ki nga punaha tauhohenga PCR Wā Tuturu e whai ake nei, ka tūtohu kia taapirihia nga moni mai i te 10-30% o te punaha tauhohenga.
C: te whakarite pūnaha tauhohenga qPCR
1.E tika ana te rahi o te B kua whakaritea ki te tauira cDNA taahiraa i runga i te ripanga 3-1 e whai ake nei hei whakarite i te punaha tauhohenga.
Tuhipoka: Ko te nui o te tauira cDNA mo te 10-30% o te punaha qPCR.Hei tauira, i roto i te punaha qPCR 20μl, taapirihia te 2-6 μl o te lysis buffer, engari kaua e neke atu i te 6 μl.
2.Ko te arotautanga pai nga tikanga qPCR (Te mahana whakaeneene, me etahi atu) mo te tauhohenga qPCR (Ko nga tikanga tauhohenga i homai i te Ripanga 3-2).
Tuhipoka: Ngana ki te whakamahi i nga tikanga papai mo nga tauhohenga qPCR kia pai ake nga hua.
Ripanga 3-1: Te Whakaritenga o te punaha tauhohenga PCR
| Pūnaha RT taapiri ihirangi | Me te nui | Te kukū whakamutunga |
| 2× Direct qPCR Mix-Taqman | 10 μl | 1× |
| Pūmua Whakamua (10μM) | 0.4 μl | 50-900 nM 1* |
| Pūmatua Whakamuri (10μM) | 0.4 μl | 50-900 nM 1* |
| Probe(10μM) | 0.2 μl | 200nM |
| tauira cDNA (i whiwhi i te taahiraa B) | 4 μl | 10-30% |
| RNase-Free ddH2O | — | |
| 20×ROX Waikano Tohutoro 3* | — | — |
| Rōrahi Tapeke | 20 μl |
1*: Ka taea te whakatika i te kukū tuatahi i roto i te awhe o te 50-900 nM ina he ngoikore te mahi tauhohenga tuatahi.
Tuhipoka: Ka taea te whakarereke i te punaha qPCR kia rite ki nga hiahia whakamatautau me te tauira o te paihikara fluorescence.Mo te qPCR i roto i te 50μl te punaha, whakatikahia te inenga reagent kia rite ki te 20μl pūnaha.
| Mīhini PCR wā tūturu | Rox Tohutoro Waikano kukū whakamutunga |
| ABI PRISM7000/7300/7700/7900HT/Step One, etc. | 1×(hei tauira. 20 μl pūnaha， tāpiri 1 μl 20×ROX Tae Tohutoro) |
| ABI 7500/7500 Tere me StratageneMx3000P/Mx3005P/Mx4000, etc. | 0.5×(hei tauira. 20 μl pūnaha, tāpiri 0.5 μl 20×ROX ReferenceDye) |
2*: Tīpakohia te kukū whakamutunga e tika ana o te Waikano Tohutoro ROX e ai ki te kaihuri hiko waiariki ine.Ko nga kohinga Waikano Tohutoro ROX e tika ana mo nga kaihurihuri ine ine noa e whakaatuhia ana i te ripanga i raro nei:
Ripanga 3-2: Ka whakaratohia nga tikanga tauhohenga qPCR
| Takirua-rua | Te pāmahana | Te wa | Nga huringa | Ihirangi |
| 1 | 95℃ | 3 min | 1 | Tuhinga o mua |
| 2 | 95℃ | 5-10 hēkona | 40 | Te whakaheke tauira |
| 3 | 60-65 ℃ | 20-30 hēkona | Whakawhana / Toronga |
Tuhipoka: Kia whiwhi ai i te huanga qPCR tino pai, ka taea te whakamahi PCR rōnaki ki te arotau i nga tikanga tauhohenga mo nga tauira rereke me nga momo tuatahi.He rereke nga tikanga tauhohenga PCR i runga i te kaitirotiro fluorescence, te tauira, te tuatahi, me era atu. I roto i te mahi motuhake, me hoahoa nga tikanga tauhohenga tino pai ki nga tikanga motuhake o te kaihurihuri waiariki ine ine, momo tauira, te rahi o te kongakonga o te paanga, te raupapa turanga o te kongakonga kua whakanuia me te ihirangi GC me te roa o nga mea tuatahi, tae atu ki te pāmahana o te reera, te wa tauhohenga, etc.
Tikanga Tuturu PCR maataapono hoahoa tuatahi
Primer Whakamua me te Primer Whakamuri
Mo PCR Wā Tuturu, he mea nui te hoahoa tuatahi.Ko nga kaupapa tuatahi e pa ana ki te motuhake me te kaha o te whakanui PCR, a ka taea te hoahoa ma te tohu ki nga kaupapa e whai ake nei:
◆ Te roa o te tuatahi: 18-30bp.
◆ GC ihirangi: 40-60%.
◆ Uara Tm: Ka taea e te rorohiko hoahoa tuatahi, penei i te Primer 5, te uara Tm o te tuatahi.Ko nga uara Tm o nga timatanga o runga me te taha whakararo kia tata tonu.Ka taea hoki te whakamahi i te tauira tatauranga Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).I te wa e mahi ana i te PCR, ka tohua te pāmahana i raro iho i te uara Tm tuatahi o te 5 °C hei pāmahana whakaenee (ka taea e te pikinga o te pāmahana whakaenee te whakanui ake i te motuhake o te tauhohenga PCR).
◆ Tuhinga o mua me nga hua PCR:
◆ Ko te roa o te hua whakakaha PCR tuatahi he pai ki te 100-150bp.
◆ Me karohia nga tauira hoahoa i te waahanga hanganga tuarua o te tauira ka taea.
◆ Me karo i te hanganga o nga turanga e 2 neke atu ranei i waenganui i nga pito 3′ o nga puna tuatahi o te awa me te whakararo.
◆ Primer 3′ karekau e taea te noho me te 3 taapiri G, C ranei.
◆ Kaore e taea e nga papa tuatahi te whai hanganga taapiri, ki te kore ka hanga he anga makawe, ka pa ki te whakakaha PCR.
◆ Me tohatoha te ATCG kia rite ki te raupapa tuatahi, a me karohia te turanga 3′ hei T.
Apitihanga1：Cell TikaRT-qPCR Waehanga ketet mōkihi tāpiri
1.Cell Lysis Solution
|
| |||
| Nga waahanga kete (24-puna puna lysis / puna) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| WahiI | Kaipupuri CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Kaipupuri ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| WahiII | Pūkōmuru DNA | 400 μl | 1 ml × 2 |
|
| |
| Nga waahanga kete (20 μl pūnaha tauhohenga) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Direct RT Mix | 800 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml × 2 |
3.QPCR Mix
|
| ||
| Nga waahanga kete (20 μl pūnaha tauhohenga) | DRT-01021-C1 | DRT-01021-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Direct qPCR Mix-Taqman | 1 ml × 2 | 1.7 ml × 6 |
| 20× ROX Waikano Tohutoro | 40 μl | 200 μl |
| RNase-Free ddH2O | 1.7 ml | 10 ml |
Tuhinga o mua o te Ao
Foregene Co., Ltd
Waea: 028-83360257, 028-83361257
E-mail ：info@foregene.com
Http://www.foregene.com
