E mohiotia ana i roto i te kaupapa matua, ko te RNA te takawaenga whakawhiti i waenga i te DNA me te whakaaturanga pūmua.Ka whakatauritea ki te kitenga o te DNA, ka taea e te kitenga o te RNA te whakaata ake i te whakaaturanga ira i roto i nga rauropi.Ko nga whakamatautau e pa ana ki te RNA ko: qRT-PCR, RNA-Seq, me te kitenga ira fusion, me etahi atu I runga i nga ahuatanga o te RNA ano (ko te mowhiti huka o te RNA he roopu hydroxyl kore utu atu i te mowhiti huka o te DNA), i honoa ki te maha o nga RNases i roto i te taiao, ko te RNA he pai ake, he ngawari ake te whakaheke i te DNA.Parapara ki roto, para ki waho, mena kaore i te pai te kounga o te RNA, katahi ka kore e pai nga hua o nga whakamatautau, kua tino kitea he raraunga kore tika, he ngoikore ranei te tukurua.Na reira, me nui ake te aro ki te tukatuka o te RNA, me te hononga o te mana o te kounga he mea nui ake ki te whakarite i te tika me te tika o nga raraunga whakamatautau ka whai ake.

Mo te whakahaere kounga o te RNA, ko nga tikanga e whai ake nei e whakamahia nuitia ana:

• Spectrophotometry
• te electrophoresis gel agarose
• Agilent Bioanalyzer
• PCR ine ine rewharewha i te wa-tūturu
• Tikanga waikano qubit fluorescent

01 Spectrophotometry

Kua honoa e te RNA nga hononga takirua, he tihi absorption i te roangaru o te 260nm.E ai ki te ture a Lambert-Beer, ka taea e tatou te tatau i te kukū RNA mai i te tihi absorption i te 260nm.I tua atu, ka taea hoki e tatou te tatau i te ma o RNA kia rite ki te ōwehenga o te 260nm, 280nm me te 230nm absorption peaks.Ko te 280nm me te 230nm nga tihi whakauru o nga pūmua me nga ngota ngota iti.Ko te tauwehenga o te A260/A280 me te A260/A230 o te maatanga RNA tohu kia nui ake i te 2. Mena he iti iho i te 2, ko te tikanga kei reira he pūmua, he iti ngota ngota i roto i te tauira RNA me pure ano.Ko nga puna poke ka pa ki nga whakamatautau o raro, penei i te aukati i te kaha whakakaha o nga tauhohenga PCR, ka puta he hua ine ine.He nui te awe o te ma o te RNA ki nga hua ka whai ake, no reira ko te spectrophotometry te tikanga he hononga mana kounga nui i te taahiraa tuatahi i roto i nga whakamatautau waikawa karihi.

Whakaahua 1. Ahuatanga RNA/DNA Absorption Spectrum

02 Te hiko o te karaehe

I tua atu i te ma, ko te tika o te RNA tetahi o nga tohu nui mo te whakatau i te kounga o te RNA.Ko te whakahekenga o te RNA ka arahi ki te maha o nga waahanga poto i roto i te tauira, na reira ka whakaitihia te maha o nga wahanga RNA ka taea te kitea me te hipoki e te raupapa tohutoro.Ka taea te tirotiro i te tika o te RNA ma te electrophoresis o te RNA katoa i runga i te 1% agarose gel.Ka taea e tenei tikanga te whirihora i te ra maau ake, ka whakamahi ranei i te punaha E-Gel™ kua oti te hanga mo te whakamatautau tika.Neke atu i te 80% o te tapeke RNA he RNA ribosom, ko te nuinga o enei ko te 28S me te 18S rRNA (i roto i nga punaha mammalian).Ko te kounga pai o te RNA ka whakaatu e rua nga pae kanapa e kitea ana, ko te 28S me te 18S nga tutaki kanapa, i te 5 Kb me te 2 Kb, ka tata ki te 2:1 te ōwehenga.Mena kei roto i te ahua rereke, ko te tikanga kua whakahekehia pea te tauira RNA, a ka tūtohu kia whakamahia te tikanga i whakaahuahia i muri mai hei whakamatautau i te kounga o te RNA.

Whakaahua 2. Te whakatairitetanga o te RNA kua paheke (te huarahi 2) me te RNA mau tonu (te huarahi 3) i runga i te hiko o te rae agarose.

03 Agilent Bioanalyzer

I tua atu i te tikanga electrophoresis gel agarose kua whakaahuahia i runga ake nei, ka awhina i a maatau ki te tautuhi i te tika o te RNA me te tere, ka taea hoki e tatou te whakamahi i te Agilent bioanalyzer ki te whakatau i te tika o te RNA.Ka whakamahia e ia he huinga o te microfluidics, capillary electrophoresis, me te fluorescence hei aromatawai i te kukū o te RNA me te pono.Mā te whakamahi i te hātepee i hangaia hei tātari i te kōtaha o te tauira RNA, ka taea e te Agilent bioanalyzer te tatau i te uara tapatahi RNA tohutoro, RNA Integrity Number (ka kiia i muri nei ko RIN) [1].Ko te nui o te uara o te RIN, ko te teitei ake o te pono o te RNA (1 te tino whakaheke, ko te 10 te tino oti).Ko etahi o nga whakamatautau e pa ana ki te RNA e whakaaro ana kia whakamahia te RIN hei tawhā mo te aromatawai kounga.Ko te tango i nga whakamatautau raupapatanga teitei (ka kiia i muri nei ko NGS) hei tauira, ko nga aratohu a Oncomine™ Human Immune Repertoire, e whakamahia ana ki te kite i nga kaiwhakawhiwhi antigen pūtau B me te pūtau T i roto i te raupapa panui Oncomine a Thermo Fisher, e kii ana ko nga tauira me nga uara RIN nui atu i te 4, Ka taea te ine i nga panui me nga tohu 3 (Figure).He rereke nga awhe e taunaki ana mo nga panui rereke, he maha nga wa ka taea e te RIN teitei ake te kawe mai i nga raraunga whai hua.

Whakaatu 3, i roto i nga whakamatautau a Oncomine™ Human Immune Repertoire, ko nga tauira me te RIN nui ake i te 4 ka taea te kite i nga panui whai hua ake me nga karaka T pūtau.【2】

Heoi ano, kei te uara RIN etahi here.Ahakoa he nui te hononga o te RIN me te kounga o nga raraunga whakamatautau NGS, kaore e pai mo nga tauira FFPE.He wa roa nga tauira FFPE e tukinotia ana ma te matū, a ko te RNA kua tangohia he iti noa te uara RIN.Engari, ehara i te mea ko nga raraunga whai hua o te whakamatautau me kore e pai.Hei aromatawai tika i te kounga o nga tauira FFPE, me whakamahi ine i tua atu i te RIN.I tua atu i te RIN, ka taea hoki e te Agilent bioanalyzer te tatau te uara DV200 hei tawhā aro mātai o te kounga RNA.Ko te DV200 he tawhā e tatau ana i te wahanga o nga kongakonga nui ake i te 200 bp i roto i te tauira RNA.Ko te DV200 he tohu pai ake mo te kounga tauira FFPE i te RIN.Mo te RNA i tangohia e te FFPE, he tino nui te hononga ki te maha o nga ira ka taea te kitea pai me te rereketanga o nga ira [3].Ahakoa ka taea e DV200 te whakatika i nga ngoikoretanga o te rapunga kounga o te FFPE, kaore e taea e te Agilent bioanalyzer te tātari matawhānui i nga raru o te kounga o nga tauira RNA, tae atu ki te mea he aukati kei roto i nga tauira.Ka taea e te hunga aukati te pa ki te kaha whakakaha o nga whakamatautau o raro me te whakaiti i te nui o nga raraunga whai hua.Ki te mohio mena he aukati kei roto i te tauira, ka taea e taatau te whakamahi i te tikanga PCR ine-a-waa-a-waa e whakaahuatia ana i muri mai.

04 PCR ine ine rewharewha i te wa-tūturu

E kore e taea e te tikanga PCR ine-a-wa-a-waa te kite i nga aukati i roto i te tauira, engari e whakaatu tika ana i te kounga o te RNA i roto i te tauira FFPE.Ki te whakatauritea ki nga kaitirotiro koiora Agilent, he pai ake te rongonui o nga taputapu ine ine rewharewha i roto i nga taiwhanga koiora nui na te whanuitanga o te whakamahinga.Hei whakamatautau i te kounga o nga tauira RNA, me hoko, me whakarite ranei nga rangahau tuatahi mo nga ira tohutoro o roto, penei i te GUSB (Cat no. Hs00939627).Ma te whakamahi i tenei huinga tuatahi, rangahau me nga paerewa (te tapeke RNA o te kukū e mohiotia ana) ki te whakahaere i nga whakamatautau ine ine, ka taea te tatau te kuhanga kongakonga RNA whai hua hei paerewa aromatawai o te kounga RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) mo te poto).I roto i te whakamatautau NGS, i kitea e matou ko te FRQ o nga tauira RNA he tino nui te hononga ki te nui o nga raraunga whai hua.Mo nga tauira katoa nui ake i te 0.2ng/uL FRQ, neke atu i te 70% o nga panui ka taea te kapi i te raupapa tohutoro (Whakaahua 4).

Ko te ahua 4, ko te uara FRQ i kitea e te tikanga inenga fluorescence he hononga tino nui (R2>0.9) me nga raraunga whai hua i whiwhi i te whakamatautau NGS.Ko te raina whero te uara FRQ e rite ana ki te 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

I tua atu i te whai waahi ki nga tauira FFPE, ka taea hoki e te tikanga PCR ine-waa te aro turuki i nga aukati i roto i nga tauira.Ka taea e tatou te taapiri i te tauira kia kitea ki roto i te punaha tauhohenga me te Mana Pai-a-roto (IPC) me tana Assay, katahi ka mahia te ine inenga ki te whiwhi i te uara Ct.Mena kei muri te uara Ct i muri i te uara Ct i roto i te tauhohenga kore-tauira, e tohu ana kei te noho te aukati i roto i te tauira me te aukati i te kaha o te whakanui i te tauhohenga.

05 Qubit tikanga waikano rewharewha

Ko Qubit Fluorometer te taputapu iti e whakamahia nuitia ana mo te kukū waikawa karihi me te rapunga parakore, he ngawari ki te whakahaere me te noho tata ki nga taiwhanga koiora irapoi katoa.He tika te tatau i te kukū o te waikawa karihi ma te kimi me te waikano fluorescent herea waikawa nucleic (Qubit detection reagent).He nui te tairongo me te motuhake o Qubit, a ka taea e ia te tatau i te RNA ki raro ki te pg/µL te kukū.I tua atu i te kaha rongonui ki te ine tika i te kukū waikawa karihi, ko te tauira hou hou a Thermo Fisher, Qubit 4.0, ka taea hoki te kite i te tika o te RNA.Ko te punaha rapunga RNA a Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) ka kite i te pono o te RNA ma te kimi i nga wa ano e rua nga waikano rewharewha motuhake.Ka taea e enei waikano rewharewha e rua te here ki nga kongakonga nui me nga kongakonga iti o te RNA.Ko enei waikano rewharewha e rua e tohu ana i te wahanga o nga kongakonga nui o te RNA i roto i te tauira, a mai i tenei ka taea te tatau te uara IQ (Tauturu me te Kounga) e tohu ana i te kounga RNA.Ko te uara IQ e pa ana ki nga tauira FFPE me nga tauira kore-FFPE, he nui te awe ki te kounga o te raupapa o muri mai.Ko te tango i nga whakamatautau NGS hei tauira, i roto i nga whakamatautau whakamatautau RNA-Seq i mahia i runga i te papaaho Ion torrent™, ko te nuinga o nga tauira me nga uara IQ nui ake i te 4 he iti rawa te 50% o nga panui whai hua (Whakaahua 5).Ka whakatauritea ki nga tikanga rapunga kua whakahuahia ake nei, ehara i te mea he pai ake te mahi a Qubit IQ Assay me te iti ake o te waa (i roto i te rima meneti), engari he hononga nui ano hoki i waenga i te uara IQ tawhā me te kounga raraunga o nga whakamatautau o raro.

Whakaatu 5, he hononga nui i waenga i te uara Qubit RNA IQ me nga panui mapi o RNA-Seq.【5】

Na roto i te kupu whakataki i runga ake nei, e whakapono ana ahau kei te tino mohio nga tangata katoa ki nga momo tikanga whakahaere kounga RNA.I roto i te mahi, ka taea e koe te whiriwhirite tikanga e rite ana ki te momo tauira me nga taputapu o naianei.Ma te whakahaere pai i te kounga o te RNA ka taea e tatou te karo i te kore o nga whakamatautau ka whai ake na te ngoikore o te kounga tauira, na reira ka penapena te waa, te kaha me te utu.

Hua tohutoro:

Kararehe Tapeke RNA Isolation Kit

Pūtau Tapeke RNA Wehewehenga Kete

tohutoro

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.Ko te RIN: he tau tapatahi RNA mo te tautapa i nga uara tapatahi ki nga inenga RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Oncomine Human Immune Repertoire Aratohu Kaiwhakamahi (Pub. Nama MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Inenga Kounga Whakarei ake mo te Aromatawai i te RNA I ahu mai i nga Tauira Tissue Whakamau-Paraffin-Taumau-Taunoa, Toxicological Sciences, Rōrahi 170, Putanga 370, Putanga 3, Akuhata3.https://doi.org/10.1093/toxsci/