Kaupapa hoahoa tuatahi (99% ka taea te whakaoti rapanga)
1. Te roa o te tuatahi: Me 15-30bp te pukapuka pukapuka, te nuinga o te 20bp.Ko te tino ahuatanga he pai ake ki te 18-24bp ki te whakarite i te motuhake, engari ko te roa o te pai, ko te wa roa ka iti ake te waahanga, ka whakaiti i te hua.
2. Ko te wa whakanui tuatahi: 200-500bp e tika ana, a ka taea te whakawhānui ake i te waahanga ki te 10kb i raro i nga tikanga motuhake.
3. Te turanga tuatahi: Ko te ihirangi o G+C kia 40-60%, he iti rawa te whakakaha o te G+C kaore i te pai, he nui rawa te G+C he ngawari ki te puta nga roopu kore-motuhake.Ko te ATGC he pai te tohatoha matapōkeretia, me te karo i nga tautau neke atu i te 5 purine, pyrimidine nucleotides ranei.Maha-gc mo te 5' mutunga me nga raupapa takawaenga ki te whakanui ake i te pumau, karohia te GC whai rawa i te pito 3', kaore he GC mo nga turanga 3 whakamutunga, kaore ranei he GC mo te 3 o nga turanga 5 whakamutunga.
4. Me karo i te hanganga tuarua i roto i nga papa tuatahi, me te karo i te whakakotahitanga i waenga i nga papa tuatahi e rua, ina koa ko te whakakii i te pito 3 ', ki te kore ka hangahia te dimer tuatahi, ka hangaia nga roopu whakakaha kore-motuhake.
5. Ko nga turanga kei te pito 3 'o nga papa tuatahi, ina koa ko nga turanga whakamutunga me nga turanga tuarua, me tino takirua kia kore ai e mate PCR na te kore takirua o nga turanga kapeka.
6. Ka taea te taapiri i nga papa tuatahi ki nga waahi wehewehe tika, a ko te raupapa whainga kua whakanuia me whai waahi tika te waahi, he mea tino pai mo te wetewete i te wehenga, te whakakao ngota rapoi.
7. Te motuhake o nga mea tuatahi: kia kore e kitea he homology o nga mea tuatahi me etahi atu raupapa i roto i te papaa raraunga raupapa waikawa karihi.
8. Ako ki te whakamahi i te rorohiko: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (He pai rawa atu tenei hoahoa ipurangi).
Ka taea e nga korero o runga ake te whakaoti i te 99% o nga raru hoahoa tuatahi.
Whakahaerehia nga taipitopito o te hoahoa tuatahi
1. Te roa o te tuatahi
Ko te roa o te tuatahi ko te 18~30 nga turanga.I te nuinga o te waa, ko te mea tino nui e whakatau ana i te pāmahana whakaeneene o te tuatahi ko te roa o te tuatahi.Ko te pāmahana whakaene o te tuatahi ka tohua (te uara Tm -5 ℃), ko etahi e whakamahi tika ana i te uara Tm.Ka taea te whakamahi i nga tauira e whai ake nei ki te tatau tatai i te mahana whakaeneene o nga mea tuatahi.
Ina iti iho te roa o te tuatahi i te 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Ina nui ake te roa o te tuatahi i te 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/roa-5℃
I tua atu, ka taea hoki te whakamahi i te maha o nga rorohiko ki te tatau i te pāmahana whakahiato, ka rereke te kaupapa tatauranga, na i etahi wa ka iti te waahi o te uara tatau.Ki te arotau i nga tauhohenga PCR, ka whakamahia nga papaariki poto rawa e whakarite ana i te mahana whakaeneene kia kaua e iti iho i te 54 ℃ mo te pai me te motuhake.
I te katoa, ka piki ake te motuhake o te tuatahi ma te wha mo ia nucleotide taapiri, na ko te roanga iti mo te nuinga o nga tono he 18 nucleotides.Ko te rohe o runga o te roa tuatahi ehara i te mea tino nui, ko te nuinga e pa ana ki te kaha tauhohenga.Na te entropy, ka roa ake te papa tuatahi, ka iti ake te tere o tana whakapiri ki te here ki te DNA e whai ana ki te hanga i tetahi tauira whenu-rua pumau mo te DNA polymerase hei here.
I te wa e whakamahi ana i nga raupaparorohiko ki te hoahoa i nga kaupapa tuatahi, ka taea te whakatau i te roa o nga mea tuatahi ma te uara TM, ina koa mo nga tuatahi o te PCR ine ine, TM=60 ℃ me te pera me whakahaere.
2.GC ihirangi
Ko te tikanga, ko te ihirangi o te G+C i roto i nga raupapa tuatahi ko te 40%~60%, me ruruku te ihirangi GC me te uara Tm o te rua o nga papa tuatahi.Mēnā he kaha te GC, AT rānei o te tuatahi, ka taea te taapiri i te nui o te hiku A, T, G me C ki te pito 5' o te tuatahi.
3. Te pāmahana whakaene
Me 5 ℃ te pāmahana o te whakaene i raro iho i te pāmahana kore.Mēnā he iti te maha o ngā tūāpapa tuatahi, ka taea te whakanui tika i te pāmahana whakaene, ka piki ake te motuhake o te PCR.Mena he nui te maha o nga turanga, ka taea te whakaheke tika i te pāmahana whakaene.Ko te rereketanga o te pāmahana whakaene i waenga i te rua o te 4 ℃ ~ 6 ℃ e kore e pa ki te hua PCR, engari ko te mea pai he rite tonu te pāmahana whakaene o te rua o nga kaimatai, he rereke i waenga i te 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. A ape i te waahanga hanganga tuarua o te tauira whakakaha
He pai ake te karo i te rohe hanganga tuarua o te tauira ina whiriwhiria te kongakonga kua whakakaha.Ka taea te matapae me te whakatau tata te hanganga tuarua o te wahanga i whäia e te pümanawa rorohiko e hängai ana, he äwhina ki te whiriwhiri tauira.Ko nga hua whakamatautau e whakaatu ana karekau te roha i te angitu ina iti iho i te 58.6lkJ/mol te kaha kore utu (△G) o te rohe ka whakawhanuihia.
5. He taurite ki te ADN
Ina he nui te raupapa DNA taunga kua whakahiatohia, ka herea pea te tuatahi ki nga wahanga maha o te DNA i whngaia, ka puta mai he roopu maha ki te hua.I tenei wa me whakamahi te whakamatautau rorohiko BLAST, paetukutuku:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Tīpakohia Tiarohia nga raupapa e rua (bl2seq).
Ko te whakapiri i nga raupapa tuatahi ki te rohe 1 me te whai i nga raupapa DNA ki te rohe 2 ka taea te whakawhiti, a ka tatauhia e BLAST te taapiri, te antisense, me etahi atu mea ka taea, na reira kaore nga kaiwhakamahi e mohio mena he mekameka mohio nga mekameka e rua.Ka taea ano e koe te whakauru i te nama GI mena ka mohio koe ki te nama GI o te raupapa i roto i te papaarangi, na reira kaore koe e whakapiri i tetahi waahanga nui o te raupapa.Ka mutu, pawhiria te Tiaro ki te 3 kia kite mena he maha nga waahi homologous o te tuatahi i roto i te DNA kua tohua.
6. tauranga tuatahi
Ko te 3 'mutunga o te tuatahi ko te waahi ka timata te toronga, no reira he mea nui kia kore e taurite te timata ki reira.Ko te mutunga 3 kia kaua e neke ake i te 3 karapīpiti G, C ranei, na te mea ka pohehe te puhipuhi tuatahi i roto i te rohe raupapa whakarangatira G+C.Ko te pito 3 'kaore e taea te hanga i tetahi hanganga tuarua, engari i roto i nga tauhohenga PCR motuhake (AS-PCR), kaore e taea te whakataurite te pito 3' o te tuatahi.Hei tauira, ki te whakanuia te rohe whakawaehere, kaua e whakamutua te 3 'mutunga o te tuatahi ki te tuatoru o nga tuunga o te codon, na te mea ko te tuatoru o nga tuunga o te codon he pai ki te heke, ka pa ki te motuhake me te pai o te whakakaha.I te wa e whakamahi ana i nga tohu tuatahi o te taapiri, tirohia te tepu whakamahi codon, whakarongo ki te manakohanga koiora, kaua e whakamahi i nga tohu tuatahi o te taapiri i te pito 3′, me te whakamahi i te kukū teitei o te tuatahi (1uM-3uM).
7. Hanganga tuarua o nga papa tuatahi
Ko nga mea tuatahi kia kaua e whai raupapa taapiri, ki te kore ko nga mea tuatahi ka takai ki roto i nga hanganga makawe, a ka pa tenei hanganga tuarua ki te herenga o nga mea tuatahi me nga tauira na te aukati i te steric.Mēnā ka whakamahia te whakatau ā-ringa, ko ngā tūāpapa kīnaki tonu o ngā tuatahi kia kaua e nui ake i te 3bp.Karekau he hononga i waenga i nga papa tuatahi e rua, ina koa me karohia te inaki o te pito 3 'ki te aukati i te hanga o nga dimer tuatahi.I te nuinga o te waa, kaua e neke ake i te 4 nga turanga karapīpiti o te homology, te whakakotahitanga ranei i waenganui i te rua o nga papa tuatahi.
8. Tāpirihia he tohu, he waahi ranei
Ko te mutunga o te 5 'he iti te paanga ki te motuhake o te whakakaha, na reira ka taea te whakarereke me te kore e pa ki te motuhake o te whakakaha.Ko te whakarerekētanga o te tuatahi 5 'mutunga ko: te taapiri i te waahi aukati i te enzyme;Ko te biotin kua tapaina, ko te fluorescence, ko te digoxin, ko te Eu3+, me etahi atu. Whakauruhia nga raupapa DNA herea pūmua;Te whakauru i nga waahi whakarereke, te whakauru me te ngaro nga raupapa whakarereke me te whakauru i nga raupapa kaiwhakatairanga, me etahi atu. Ko nga turanga taapiri ka nui ake, iti ake ranei te pa ki te kaha o te whakanui me te whakanui ake i te waahi o te hanganga dimer tuatahi, engari me whakarite etahi whakaaetanga mo te mahi ka whai ake.Ko etahi atu raupapa karekau i runga i te raupapa whaainga, penei i nga waahi aukati me nga raupapa kaiwhakatairanga, ka taea te taapiri atu ki te mutunga 5′ o te tuatahi me te kore e pa ki te motuhake.Ko enei raupapa karekau i whakauruhia ki roto i te tataunga o nga uara Tm tuatahi, engari me whakamatau mo te whakaurunga me te hanganga tuarua o roto.
9. Karakaroto
Ko te nuinga o nga wa, ko te PCR he kootingo tuatahi noa iho, katahi ka hiahia taatau ki te tuku i te kongakonga whainga ki roto i nga momo vectors, no reira me hoahoa etahi atu turanga mo te mahi e whai ake nei i te taahiraa PCR.
Ko etahi o nga raupapa i hangaia mo te whakakaoruatanga kua whakarāpopotohia ki raro nei.
I taapirihia te waahi aukati endonuclease
Ko te taapiri i nga waahi aukati i te enzyme ko te tikanga e whakamahia nuitia ana mo te whakamaarama i nga hua PCR.Ko te tikanga, e ono nga turanga o te waahi wehewehe, hei taapiri atu ki te 5 'mutunga o te waahi wehenga me taapiri kia 2 ~ 3 nga turanga whakamarumaru.Heoi, he rereke te maha o nga turanga whakamarumaru e hiahiatia ana e nga rereke rereke.Hei tauira, karekau he turanga whakamarumaru a SalⅠ, kia 1 te turanga whakamarumaru a EcoRⅤ, Kia 2 nga turanga whakamarumaru, a Hind Ⅲ kia 3 nga turanga whakamarumaru.
Ka taapirihia e LIC te hiku
Ko te ingoa katoa o te LIC ko te Ligation-Independent cloning, he tikanga cloning i hangaia e Navogen mo tana wahanga o te pET vector.Ko te kaikawe pET i whakaritea ma te tikanga LIC he 12-15 te turanga o nga whenu kotahi nga pito piri, e whakakii ana i nga pito piri ki runga i te mahanga whakauru.Mo te whakanui ake, ko te raupapa tuatahi 5′ o te kongakonga kua whakauruhia me whakakii i te vector LIC.Ka taea e te ngohe 3′→5′ o te T4 DNA polymerase te hanga i te whenu kotahi te pito piri ki runga i te kongakonga kua whakauruhia i muri i te wa poto.Na te mea ka taea anake te hanga i te hua mai i te whakakotahitanga tahi o te kongakonga whakauru kua oti te whakarite me te vector, he tino tere, he pai hoki tenei tikanga, a he mea whakahau ki te cloning.
Ko te toka a TA te taapiri i te hiku
Kaore i taea e TA cloning te whakangao i te kongakonga ki roto i te vector, no muri mai ka whakaurua e Invitrogen he vector ka taea te aro ki te cloning, kei roto e wha te turanga rongonui GTGGS i tetahi pito.Na reira, i roto i te hoahoatanga o nga papa tuatahi PCR, me taapiri nga raupapa taapiri kia rite, kia taea ai te "whakaaro" nga kongakonga.
Mēnā he poto tō wā, ka taea e koe te whakamātau i te kōtuitanga tika, te whakakotahi i te ira me te vector, e kiia nei ko te ET gene synthesis i roto i nga tohunga puoro.
D. In-Fusion tikanga cloning
Kaore e hiahiatia he ligase, kaore he tauhohenga roa e hiahiatia ana.I te mea ka whakauruhia he raupapa i nga pito e rua o te vector raupapa I roto i te hoahoa o nga mea tuatahi, katahi ka whakauruhia te hua PCR me te vector raina ki roto i te otinga enzyme in-fusion kei roto te BSA ka tuu ki te pāmahana rūma mo te hawhe haora, ka taea te whakarereke.He tino pai tenei tikanga mo te hurihanga nui.
10. Hanumi tuatahi
I etahi wa, he iti noa nga korero raupapa e mohiotia ana mo te hoahoa tuatahi.Hei tauira, mena ko te raupapa waikawa amino anake e mohiotia ana, ka taea te hoahoa te whakakotahitanga tuatahi.Ko te tuatahi hanumi he ranunga o nga raupapa rereke e tohu ana i nga momo turanga rereke katoa e whakawaehere ana i te waikawa amino kotahi.Hei whakanui ake i te motuhaketanga, ka taea e koe te titiro ki te tepu whakamahi codon hei whakaiti i te taapiri i runga i nga hiahia o nga momo rauropi.Ka taea te honohia te Hypoxanthine ki nga turanga katoa hei whakaiti i te mahana whakaene o te tuatahi.Kaua e whakamahia nga turanga apitihia i te pito 3′ o te tuatahi na te mea ko te whakahianga o nga turanga e 3 whakamutunga i te pito 3′ e ranea ana hei timata i te PCR ki te waahi he.He nui ake te kuhanga tuatahi (1μM ki te 3μM) na te mea karekau he mea motuhake ki te tauira whainga nga mea tuatahi i roto i te maha o nga ranunga taapiri.
PCR raw rauemimana whakahaere
1. Te rahinga tuatahi
Ko te kukū o ia tuatahi ko te 0.1 ~ 1umol ranei 10 ~ 100pmol.He pai ake te whakaputa i te hua e hiahiatia ana me te iti rawa o te tuatahi.Ko te nui o te kukū o te tuatahi ka puta te kore orite me te whakakaha kore-motuhake, ka nui ake te tupono ki te hanga dimer i waenga i nga papa tuatahi.
2. Te kukū tuatahi
Ko te kukū o nga primers ka pa ki te motuhake.Ko te kukū tuatahi tino pai i waenga i te 0.1 me te 0.5μM.Ko te nui ake o nga kohinga tuatahi ka kaha ake nga hua kore motuhake.
3. Te pāmahana whakaenea o te tuatahi
Ko tetahi atu tawhā nui mo nga papa tuatahi ko te pāmahana rewa (Tm).Koinei te pāmahana ka tohuhia te 50% o nga papa tuatahi me nga raupapa taapiri hei ngota ngota ngota DNA paerua.Ko te Tm e hiahiatia ana hei whakarite i te pāmahana whakamahana PCR.Ko te mea pai, he iti rawa te pāmahana whakaene ki te whakapumau i te whaihua o te whakaeneene o nga kaimatai me te raupapa whaainga, engari he nui ki te whakaiti i te herenga kore.He pai te pāmahana whakaeneene mai i te 55 ℃ ki te 70 ℃.I te nuinga o te waa ka whakatauhia te pāmahana whakahiato 5 ℃ iti iho i te Tm o te tuatahi.
He maha nga tauira mo te tautuhi i te Tm, he rereke te rereke i runga i te tauira e whakamahia ana me te raupapa o nga timatanga.I te mea ko te nuinga o nga tauira e whakarato ana i te uara Tm, he timatanga noa nga pāmahana whakaeneene katoa.Ka taea te whakapai ake i te motuhake ma te wetewete i nga tauhohenga maha e piki haere ana te pāmahana whakaene.Tīmatahia i raro i te Tm-5 ℃, ka piki haere te pāmahana whakaene i roto i te pikinga o te 2 ℃.Ko te teitei ake o te wera whakaene ka whakaiti i te hanganga o nga dimer tuatahi me nga hua kore-motuhake.Mo nga hua tino pai, me whai uara Tm tata ki nga papa tuatahi e rua.Mēnā he nui ake te rerekētanga Tm o ngā takirua tuatahi i te 5 ℃, ka whakaatuhia e ngā pūmua he tīmatanga teka nui mā te whakamahi i te iti iho o te pāmahana whakaene i roto i te huringa.Mēnā he rerekē ngā pūmua e rua Tm, whakatauhia te pāmahana whakaeneene ki te 5 ℃ ki raro iho i te Tm iti rawa.Ko te tikanga, hei whakanui ake i te motuhake, ka taea te mahi e rima nga huringa i te tuatahi i nga pāmahana whakaenee i hangaia mo te Tm teitei ake, whai muri ko nga toenga o nga huringa i te pāmahana whakaenee i hangaia mo te Tm iti.Ma tenei ka taea te tango i tetahi kape waahanga o te tauira whainga i raro i nga tikanga uaua.
4. Primer parakore me te pūmautanga
Ko te maatanga paerewa o nga taketake ritenga e tika ana mo te nuinga o nga tono PCR.Ko te tango i nga roopu benzoyl me te isobutylyl ma te whakakore i te tote he iti, na reira kaore e pokanoa ki te PCR.Ko etahi tono e hiahia ana kia purea hei tango i nga raupapa kore-katoa i roto i te tukanga whakahiato.Ko enei raupapa kua tapahia na te mea kaore i te 100% te pai o te matū whakahiato DNAHe tukanga porohita tenei e whakamahi ana i nga tauhohenga matū tukurua i te mea ka taapirihia ia turanga ki te hanga DNA mai i te 3' ki te 5'.Ka taea e koe te taka i roto i ia huringa.Ko nga papa tuatahi roa ake, ina koa ko nga mea nui ake i te 50 nga turanga, he nui te waahanga o nga raupapa kua tapahia, me te purenga pea.
Ko te hua o nga mea tuatahi ka pa ki te pai o te matū waihanga me te tikanga purenga.Ko nga kamupene biopharmaceutical, penei i te Cytology me Shengong, ka whakamahi katoa i te waahanga OD iti rawa hei whakarite i te katoa o nga putanga o te oligonucleoside.Ka tukuna nga mea tuatahi ki te ahua paura maroke.He pai ki te whakakore ano i nga mea tuatahi i TE kia 100μM te kukū whakamutunga.He pai ake te TE i te wai kaoona na te mea he waikawa te pH o te wai, ka puta te hauwai o oligonucleosides.
Ko te pumau o nga mea tuatahi ka whakawhirinaki ki nga tikanga rokiroki.Me penapena te paura maroke me nga mea kua rewa ki te -20 ℃.Ka taea te penapena i nga kaupapa tuatahi kua memeha i TE i nga kukū nui ake i te 10μM i -20 ℃ mo te 6 marama, engari ka taea anake te penapena i te pāmahana rūma (15 ℃ ki te 30 ℃) mo te iti iho i te 1 wiki.Ka taea te penapena i nga putunga paura maroke ki te -20 C mo te iti rawa 1 tau me te pāmahana rūma (15 C ki te 30 C) mo te 2 marama.
5. Enzymes me o ratou kukū
I tenei wa, ko te Taq DNA polymerase e whakamahia ana ko te whaakiki miihini ira i whakahiatohia e te huakita coliform.Ko te nui o te whākōkī e hiahiatia ana hei whakakorikori i te tauhohenga PCR angamaheni he 2.5U(e tohu ana ki te tapeke o te rōrahi tauhohenga o te 100ul).Mena he tiketike rawa te kukū, ka taea te whakakaha kore-motuhake;ki te iti rawa te kukū, ka heke te nui o te hua waihanga.
6. Kounga me te kukū o te dNTP
Ko te kounga o te dNTP e hono tata ana ki te kukū me te kaha o te whakanui PCR.He kirikiri te paura dNTP, ka ngaro tana mahi koiora ki te hee te penapena.Ko te otinga dNTP he waikawa, me whakamahi i roto i te kukū teitei, me te 1M NaOH, te 1M Tris.HCL te otinga parepare hei whakatika i tana PH ki te 7.0 ~ 7.5, te iti o te kohinga iti, te rokiroki tio i -20 ℃.Ka whakahekehia te dNTP ma te maha o nga whakatio-rewa.I te tauhohenga PCR, me 50 ~ 200umol/L te dNTP.Ina koa, me aro ki te kukū o nga DNTPS e wha kia rite (te whakarite mole rite).Mēnā he rerekē te kukū o tētehi o ērā atu i ētehi atu (he teitei ake, he iti ake rānei), ka puta te hē.Ko te iti o te kukū ka whakaiti i te hua o nga hua PCR.Ka taea e dNTP te whakakotahi me te Mg2+ me te whakaiti i te kukū o te Mg2+ kore utu.
7. Tātauira (ira ira) waikawa nucleic
Ko te nui me te tohu purenga o te tauira waikawa nucleic tetahi o nga hononga matua mo te angitu me te kore o PCR.Ko nga tikanga purenga DNA tuku iho ka whakamahia te SDS me te protease K ki te keri me te tuku tauira.Ko nga mahi matua o te SDS ko: te whakakore i nga lipids me nga pūmua i runga i te membrane pūtau, na reira ka whakangaro i te membrane pūtau ma te whakakore i nga pūmua membrane, me te wehewehe i nga pūmua karihi i roto i te pūtau, ka taea hoki e te SDS te whakakotahi me nga pūmua me te whakaheke;Ka taea e te Protease K te hauwai me te keri i nga pūmua, ina koa nga histones e herea ana ki te DNA, katahi ka whakamahi i te phenol whakarewa pararopi me te chloroform ki te tango i nga pūmua me etahi atu waahanga pūtau, ka whakamahi i te waiwaro, i te waipiro isopropyl ranei hei whakaheke i te waikawa karihi.Ka taea te whakamahi i te waikawa karihi i tangohia hei tauira mo nga tauhohenga PCR.Mo nga tauira rapunga haumanu whanui, ka taea te whakamahi i tetahi tikanga tere me te ngawari ki te whakakore i nga pūtau, ki te lysate tukumate, ki te keri me te tango i nga pūmua mai i nga chromosomes ki te whakaatea i nga ira whainga, me te whakamahi tika mo te whakakaha PCR.Ko te tangohanga tauira RNA i te nuinga o te wa ka whakamahia te tikanga guanidine isothiocyanate, protease K ranei hei aukati i te RNase i te whakaheke i te RNA.
8.Mg2+ kukū
Ko te Mg2+ he painga nui ki te motuhake me te hua o te whakanui PCR.I roto i te tauhohenga PCR whānui, ka 200umol/L te kukū o ngā momo dNTP, ko te kukū tika o Mg2+ he 1.5 ~ 2.0mmol/L.He tiketike rawa te kukū Mg2+, ka heke te tauhohenga tauhohenga, ka puta te whakakaha kore-motuhake, ka iti rawa te kukū ka whakaiti i te ngohe o te Taq DNA polymerase, ka mutu te whakahekenga o nga hua tauhohenga.
Ko nga katote konupora e pa ana ki etahi ahuatanga o te PCR, penei i te ngohe DNA polymerase, e pa ana ki nga hua;Ko tetahi atu tauira ko te whakauru tuatahi, e pa ana ki te motuhake.Ka herea te dNTP me te tauira ki te katote konupora, ka whakaiti i te nui o te katote konupora kore utu e hiahiatia ana mo te mahi enzyme.He rereke te kuhanga katote konupora tino pai mo nga takirua tuatahi me nga tauira, engari ko te kukū katote PCR angamaheni me te 200μM dNTP he 1.5mM (whakatupato: Mo te PCR ine ine-wa, whakamahia te otinga katote konupora 3 ki te 5mM me te rangahau korakora).Ko te kaha ake o nga katote konupora kore utu ka piki ake te hua, engari ka piki ake te whakakaha kore motuhake me te whakaheke i te pono.Hei whakatau i te kukū tino pai, ka mahia nga titrations katote konupora i roto i nga pikinga o te 0.5mM mai i te 1mM ki te 3mM.Hei whakaiti i te ti'aturi ki te arotautanga katote konupora, ka taea te whakamahi i te Platinum Taq DNA polymerase.Ka taea e Platinum Taq DNA polymerase te pupuri i te mahi i runga i te whānuitanga o nga kuhanga katote konupora i te Taq DNA polymerase, na reira me iti ake te arotautanga.
9. Pcr-whakatairanga tāpiritanga
Ko te arotautanga o te pāmahana whakaene, te hoahoa tuatahi, me te kukū katote konupora he rawaka mo te whakakaha tino motuhake o te nuinga o nga tauira;engari, ko etahi tauira, tae atu ki era he nui te ihirangi GC, me whai ine taapiri.Ko nga taapiri e pa ana ki te pāmahana rewa o te DNA e whakarato ana i tetahi atu huarahi hei whakapai ake i te motuhake o te hua me te tuku.Ko te whakahekenga o te tauira ka hiahiatia mo nga hua pai.
I tua atu, ka aukati te hanganga tuarua i te herenga tuatahi me te toronga o te enzyme.
Ko nga taapiri PCR, tae atu ki te formamide, DMSO, glycerin, betaine, me te PCRx Enhancer Solution, ka whakarei ake i te whakanui.Ko ta raatau tikanga ka taea te whakaiti i te pāmahana rewa, na reira ka awhina i te whakamaaramatanga o nga mea tuatahi me te awhina i te toronga polymerase DNA i roto i te rohe hanganga tuarua.He painga ano to PCRx Solution.Ko te arotautanga katote konupora iti ka hiahiatia ina whakamahia me te Platinum Taq DNA polymerase me te Platinum Pfx DNA polymerase.Na, ko te tikanga Platinum te whakakotahi me te taapiri hei whakanui ake i te motuhake i te whakaiti i te whakawhirinaki o te huarahi tuatoru, te arotautanga katote konupora.Mo nga hua pai, me arotau te kukū o nga taapiri, ina koa ko DMSO, formamide, me te glycerol, e aukati ana i te Taq DNA polymerase.
10. Te timatanga wera
Ko te PCR timata wera tetahi o nga tikanga tino nui ki te whakapai ake i te motuhake PCR hei taapiri mo te hoahoa tuatahi.Ahakoa ko te 72 ℃ te paemahana whakaroatanga tino pai o te Taq DNA polymerase, ka noho kaha te polymerase i te pāmahana rūma.No reira, ka puta nga hua kore-motuhake i te wa e iti ake ana te pāmahana pupuri i te pāmahana o te annealing i te wa e whakarite ana te tauhohenga PCR me te timatanga o te huringa waiariki.Ka oti te hanga, ka kaha te whakanui ake i enei hua kore.He tino whai hua te PCR wera-tīmata ina whakawhäitihia nga waahi e whakamahia ana mo te hoahoa tuatahi e te waahi o nga huānga ira, penei i te whakarereketanga o te waahi, te whakamaarama korero, te hanga me te raweke i nga huānga ira e whakamahia ana mo te hangarau DNA.
Ko te tikanga noa ki te whakawhāiti i te mahi a Taq DNA polymerase ko te whakarite i te otinga tauhohenga PCR ki runga i te hukapapa me te whakanoho ki roto i te taputapu PCR kua whakamahana.He ngawari tenei tikanga me te kore utu, engari kaore i te whakaoti i nga mahi o te enzyme na reira kaore e tino whakakorehia te whakanui i nga hua kore-motuhake.
Ko te whakamaarama wera e whakaroa ana i te whakahiato DNA ma te aukati i tetahi waahanga nui kia tae ra ano te taputapu PCR ki te pāmahana denaturation.Ko te nuinga o nga tikanga whakaoho waiariki a-ringa, tae atu ki te whakaroa i te taapiri o te Taq DNA polymerase, he uaua, ina koa mo nga tono teitei.Ko etahi atu tikanga whakamaarama waiariki e whakamahi ana i te parepare ware pi ki te koopaki i tetahi waahanga nui, tae atu ki nga katote konupora me nga whaakiki, ki te wehe tinana ranei i nga waahanga hohenga, penei i nga tauira me nga parepare.I roto i te huringa waiariki, ka tukuna nga momo waahanga ka konatunatua tahi ka rewa te ware pi.Pērā i te tikanga tīmatanga wera ā-ringa, he uaua te arai ārai ware pi, ka pā ki te poke, ā, kāore i te pai mō ngā tono whakaputa nui.
Ko te Platinum DNA polymerase he watea, he pai hoki mo te PCR tiimata wera aunoa.Ko te Platinum Taq DNA polymerase kei roto i te recombinant Taq DNA polymerase me te monoclonal antibody ki te Taq DNA polymerase.Ko nga paturopi he mea hanga e te PCR hei aukati i te mahi o te whanariki i te wa e mau ana te pāmahana roa.I tukuna a Taq DNA polymerase ki roto i te tauhohenga i te wa o te 94 ℃ whakamaaramatanga o te hikoi denaturation, hei whakaora i te mahi polymerase katoa.He rereke ki te Taq DNA polymerase kua whakarereketia mo te whakamaarama waiariki, kaore e hiahiatia e te konukawata Platinum te whakamaarama roa i te 94 ℃ (10 ki te 15 meneti) hei whakahohe i te polymerase.Ma te PlatinumTaq DNA polymerase, 90% o Taq DNA polymerase i whakahokia mai i muri i te 2 meneti i te 94 ℃.
11. Kohanga-PCR
Ka taea e nga rauna whakahiato whai muri ma te whakamahi i nga mea tuatahi kohanga hei whakapai ake i te motuhake me te tairongo.Ko te rauna tuatahi he whakakaha paerewa o te 15 ki te 20 huringa.He hautanga iti o te hua whakakaha tuatahi i waimeha 100 ki te 1000 nga wa, ka taapiri atu ki te rauna tuarua o te whakakaha mo te 15 ki te 20 huringa.Hei taapiri, ko te hua tuatahi kua whakanuia ka taea te rahi ma te purenga gel.Ka whakamahia he tuatahi kohanga i roto i te rauna tuarua o te whakakaha, ka taea te here ki te raupapa whainga i roto i te tuatahi tuatahi.Ko te whakamahi i te PCR kohanga ka whakaiti i te kaha ki te whakanui ake i nga waahi whainga maha na te mea he iti noa nga raupapa whaainga e hono ana ki nga huinga tuatahi e rua.He rite tonu te tapeke o nga huringa (30 ki te 40) me te rite o nga timatanga i whakanuia nga waahi kore motuhake.Ko te Nested PCR te whakanui ake i te tairongo o nga raupapa whainga iti (hei tauira, te onge mrnas) me te whakapai ake i te motuhake o nga PCRS uaua (hei tauira 5′ RACE).
12. Whakaheke PCR
Ko te PCR heke he whakapai ake i te motuhake ma te whakamahi i nga tikanga whakaeneene kiki mo nga huringa tuatahi o te PCR.Ka timata te huringa i te pāmahana whakaenee tata ki te 5 ℃ teitei ake i te Tm i whakatauhia, katahi ka whakahekehia ia huringa ma te 1 ℃ ki te 2 ℃ tae noa ki te iti o te pāmahana whakaenee ki raro i te Tm 5 ℃.Ko te tauira whainga me te homology teitei ka whakanuia.Ka piki haere tonu enei hua i roto i nga huringa o muri mai, ka kookirihia nga hua kore motuhake.He pai te PCR heke mo nga tikanga kaore i te mohiotia te tohu o te homology i waenga i te tauira tuatahi me te tauira whainga, penei i te AFLP DNA tapumati.
Nga kete PCR e pa ana
Ko te 2 × PCR HeroTMHe teitei ake te manawanui o te punaha whakaranu ki nga aukati PCR i te punaha PCR Mix noa, a ka ngawari ki te whakatutuki i te whakakaha PCR o nga momo tauira uaua.Ko te punaha tauhohenga ahurei me te kaha nui o Taq Hero ka nui ake te kaha o te whakakaha, te motuhake me te tairongo o te tauhohenga PCR.
He pai ake te whakakaha ake
He 5'→3' te mahi polymerase DNA me te 5'→3' mahi exonuclease, kaore he mahi exonuclease 3'→5'.
Wā Tuturu PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Ka taea e te parepare kua tino arotautia me te wera-whana Taq enzyme te aukati i te whakakaha kore-motuhake me te hanga dimer tuatahi
Te tairongo teitei—ka kitea nga kape iti o te tauira
RT-PCR Easyᵀᴹ I(Kotahi Hipanga)
Ka whakamahia e te kete he reagent whakawhiti whakamuri motuhake a Foregene me te Foregene HotStar Taq DNA Polymerase i honoa me te punaha tauhohenga ahurei kia pai ake ai te kaha whakakaha me te motuhake o te tauhohenga.
Wā tuku: Mei-09-2023
